一条 87 个氨基酸的小肽，先把 CXCR5 拉到脂筏，再把 PI3Kγ 点燃，细胞骨架瞬间换向

分子身份：87 aa，三对二硫键，一个肝素结合补丁

成熟肽 1–87 位，Cys11-Cys50、Cys12-Cys34、Cys35-Cys67 三对二硫键决定 β 折叠骨架；Lys28-Lys29-Lys63 组成正电补丁，负责锚定内皮糖萼，局部浓度瞬间提升 10 倍。突变任何一对二硫键，趋化活性掉到 20%，骨架一散，CXCR5 找不到表位。

受体逻辑：CXCR5 先二聚，再拉脂筏

CXCL13 与 CXCR5 亲和力 8 nM，结合后受体在 30 s 内形成二聚体，脂筏标记 cholera toxin B 聚集成点状。脂筏完整时，下游 Gi 才能释放 Gβγ，PI3Kγ 被拉到膜上。用 MβCD 抽掉胆固醇，脂筏消失，CXCR5 依旧结合，趋化指数掉到 10%，说明“看见配体”不等于“能走”。

信号级联：PI3Kγ-PKCζ 管方向，ROCK 管收缩

PI3Kγ 产生 PIP3，招募 PKCζ，磷酸化 ERM 蛋白，把微绒毛变成板状伪足；ROCK2 激活 MLC 磷酸化，尾部收缩，细胞速度提升到 12 μm/min。PI3Kγ 抑制剂 AS605240 100 nM 处理，速度掉到 3 μm/min，方向感消失，细胞原地打转。

基质锚定：肝素链让梯度变陡峭

CXCL13 的 Lys63 与内皮 heparan sulfate 亲和力 0.3 μM，结合后形成固定梯度。用肝素酶 III 把糖链剪掉，可溶梯度瞬间均匀，B 细胞穿越 5 μm 孔膜数量减少 70%。3D 胶原实验里，提前 30 min 加肝素酶，可验证锚定是否关键，缺这一步数据常被审稿人质疑“生理相关性不足”。

细胞类型谱：B 细胞第一，Tfh 第二，胶质瘤第三

na?ve B 细胞 CXCR5 表达量 50 k/cell，10 ng/mL CXCL13 即可产生最大趋化；Tfh 亚群 CXCR5 30 k/cell，需要 50 ng/mL 才饱和；胶质瘤 U251 CXCR5 仅 5 k/cell，100 ng/mL 才能启动迁移。做肿瘤实验先测流式 CXCR5 MFI，<500 直接换细胞系，别让低表达浪费蛋白。

分泌时钟：IL-1β 先升，TNF-α 接力，CXCL13 晚 6 h

原代成纤维细胞被 IL-1β 刺激 3 h，CXCL13 mRNA 开始升高，6 h 达峰；TNF-α 加入后延长半衰期到 12 h。双因子联用可把蛋白推至 8 ng/mL，单用 IL-1β 仅 2 ng/mL。收集条件培养基做趋化实验，先 10 ng/mL IL-1β 孵育 24 h，能省去外加蛋白 70% 成本。

反馈脱敏：持续刺激 4 h，CXCR5 内化 60%

100 ng/mL 连续刺激 4 h，CXCR5 通过 β-arrestin2 途径内化，膜表面受体剩 40%，细胞对梯度失去响应。设计 Transwell 实验时，下室 3 h 后必须换液，避免受体脱敏导致迁移数骤降，却误以为是抑制剂无效。

检测技巧：β-arrestin 招募比钙流更早

钙流荧光法 30 s 才出峰，β-arrestin2 招募在 5 s 就能检测到。用 split-luc 报告基因，加入 10 ng/mL CXCL13，5 s 发光信号升高 10 倍，Z’>0.7，适合做高通量抑制剂初筛。钙流法背景抖动大，Z’仅 0.4，命中率虚高。