1. 实验设计：先算后做

• 孔径选择：6 孔板划痕宽度≈1 mm，12 孔板≈0.5 mm。12 孔板节省 50% 试剂，适合高通量
• 细胞密度：划痕边缘需 100% 融合，推荐 2.5×10? cells/孔（6 孔板），过夜培养 12 h 即可达标
• EGF 浓度梯度：10 ng/mL 起跳，2 倍稀释到 160 ng/mL，预实验先跑 5 点，找到 EC50 后再缩窄窗口

2. 铺板与划痕：一次成型

• 枪头法：200 μL 黄枪头垂直壁面，一次拉到底，速度 1 cm/s，倾斜角 30°，划痕弯曲度 <3%
• 模具法：3D 打印硅胶插片，厚度 0.3 mm，拆片后边缘整齐，CV 值降到 5% 以内
• 清洗：PBS 轻冲 2 次，去掉脱落细胞，动作慢，水流速 <0.5 mL/s，避免二次损伤

3. EGF 刺激与成像节点

• 0 h 点：划痕后 30 min 内完成首拍，超时会记录到假性回缩
• 加入方式：37 °C 预温培养基，沿壁缓慢加入，防止冲散单层
• 成像节奏：0、6、12、24 h，每孔 3 视野，10× 物镜即可分辨单个细胞，文件命名统一“孔-视野-时间点”，后期批处理不出错

4. 图像分析：ImageJ 脚本

• 伤口面积插件：Wound Healing Tool，阈值设定 30–255，自动算出剩余面积
• 迁移速率公式：(A?－A?)/A? × 100%，单位 %/h
• 脚本批处理：宏命令循环 96 张图，3 min 出完整表，Excel 直接调用

5. 数据质控：剔除异常

• 边缘脱落：划痕边界出现锯齿，面积 CV>15%，整孔作废
• 细胞增殖干扰：Mitomycin C 10 μg/mL 预处理 1 h，24 h 内增殖率 <3%，迁移数据纯化
• 焦距漂移：每板留 1 孔空白，实时校准，Z 轴误差 ±2 μm 以内

6. 故障排查速查表

7. 结果呈现：排版出图

• GraphPad 样式：横轴时间 h，纵轴迁移率 %，误差线 SEM，n≥3
• 热图叠加：用 ImageJ 合成 0 h 与 24 h 伪彩，红绿对比，审稿人一眼看懂
• 原始数据上传：Figshare 或 Mendeley，DOI 引用，符合期刊开放数据要求

8. 进阶玩法

• CRISPR 敲除：EGFR KO 细胞做同步对照，验证通路特异性
• 微图案化：在 50 μm 宽线条上划痕，细胞只能单向迁移，消除方向噪声
• 活细胞工作站：37 °C 5% CO? 舱内实时拍，每 15 min 一帧，生成迁移轨迹热图