1. 基因与亚型

• 染色体定位：3q22.1，长度 33 kb，含 17 外显子
• 主转录本：NM_001063.3，2 346 bp，编码 698 氨基酸（含 19 aa 信号肽）
• 天然亚型：TF-Fe3? 全糖链，TF-apo 脱铁，TF-Fe3?-Fe3? 双饱和；等电点差 0.4，IEF 可分辨

2. 蛋白结构坐标

• 分子量：apo-TF 75.2 kDa，饱和两个 Fe3? 后 76.0 kDa；SDS-PAGE 表观 79 kDa 由糖基化贡献
• 晶体结构：PDB 3V83，分辨率 2.4 ?，N 叶与 C 叶各一个高亲和力 Fe3? 位点，碳酸氢根协同配位
• 糖基化位点：Asn413 与 Asn611 复杂型双天线，CHO 表达产物唾液酸化占 28 %，半衰期延长 1.8 倍

3. 铁结合化学

• 稳定常数：KFe3? = 1022 M?1每叶，pH 7.4 下饱和浓度 0.4 μg/mL；pH <5.5 铁释放 t? <2 min
• 碳酸氢根需求：摩尔比 2:1 (HCO??:TF)，缺碳酸氢根时结合率下降 90 %，缓冲液需补 25 mM NaHCO?
• 光谱指纹：Fe3?-TF 470 nm 吸收峰，ε = 2.6×103 M?1cm?1，实验室快速测饱和率只需 1 μL 样本

4. 受体亲和

• TFRC/CD71：Kd 1.2 nM（pH 7.4），Kd 5 nM（pH 6.0），酸化内体仍保持结合；过表达 CHO 细胞 2×10? 拷贝/细胞
• 转铁蛋白受体 2 (TFR2)：Kd 30 nM，主要感知铁负荷，突变导致血色病 3 型
• 批量 SPR 数据：SA 芯片固化 TF-apo，注射 Fe3? 后实时观察构象变化，Rmax 提高 1.9 倍，可筛选小分子阻断剂

5. 纯度与杂质红线

• SDS-PAGE 单带 ≥99 %：银染无杂带；出现 50 kDa 条带提示铁释放后的构象降解，活性下降 40 %
• HPLC-SEC：主峰 ≥98 %，聚集体 <1 %；聚集体过高会触发巨噬细胞 TLR4，IL-6 背景飙高
• 内毒素：临床级 <0.1 EU/mg；细胞治疗用 <0.05 EU/mg，高于此值 DC 成熟标记 CD83 假阳性

6. 糖型与批次一致

• IEF 指纹：apo-TF 5.4–5.8 五连条带；任何批次与参考带型偏差 >0.1 pI 单位需拒收
• 唾液酸比例：≥85 % α2,3-连接，确保肝脏清除率稳定；α2,6 过高使半衰期缩短 30 %
• MALDI-TOF 糖谱：CHO 表达 18 种糖型，EU 药典规定主峰 (G2S2) 面积 40–60 %，超限触发回顾性验证

7. 溶解与保存

• 速溶：100 mg 加 10 mL 无菌 20 mM HEPES + 150 mM NaCl + 25 mM NaHCO?，pH 7.4，轻摇 2 min 澄清
• 冻干保护：5 % 海藻糖 + 0.01 % Tween-80，?20 °C 一年活性下降 <3 %；不加糖冻干聚集率 >15 %
• 铁饱和操作：加入 2 倍摩尔 Fe3?-NTA，避光 30 min，470 nm 吸光度平台即饱和；过量铁用 1 mM EDTA 透析去除

8. 检测技术参数

• ELISA：CD71 竞争法，检测范围 0.5–32 ng/mL，批内 CV 4 %；用于培养液消耗速率计算
• 铁饱和率 UV 法：A470/A280 比值 0.047 为 100 % 饱和；0.013 为 apo；线性区间 r2 >0.999
• 单分子阵列 Simoa：LOD 0.02 ng/mL，CV 5 %，可测脑脊液微量 TF，评估血-脑屏障完整性

9. 重组工艺对比

• CHO：糖基化真型，产量 1.2 g/L，成本 ￥12 k/g；临床级首选
• 水稻胚乳：无糖基，半衰期 14 h，产量 2.5 g/kg 糙米，成本 ￥3 k/g，适合口服铁递送研究
• 酵母 Pichia：高甘露糖型，肝清除快，产量 3 g/L，内毒素 <0.01 EU/mg，适合抗体制备

10. 质控放行硬指标

• 铁结合容量：每 mg TF 结合 1.4 μg Fe3?，偏差 ±5 %；低于 1.25 μg 拒收
• 受体结合 SPR：TFRC 固化芯片，kon 1.2×10? M?1s?1，koff 1.4×10?3 s?1，与参考批次 Rmax 差异 <10 %
• 无菌与病毒清除：0.1 μm 过滤 + 20 nm 纳滤，LRV ≥6；支原体 28 天培养阴性，符合 EP 2.6.7