双抗体夹心架构：抗 CD66e 单克隆 12C6 锁定 N 端表位

CEA 属于糖基化程度 60 % 的巨分子，选表位需避开糖链。12C6 识别 N 端非糖基化 15 肽，亲和力 Ka=2.3×1011 L/mol，捕获效率 > 95 %。检测抗体 8H5 结合 A3 结构域，与 12C6 相距 9 nm，空间位阻为零，保证大分子夹心后仍保留 HRP 活性。

酶标放大：HRP 定向偶联 1:1 摩尔比活性最高

8H5 经胃蛋白酶切 Fc 后得到 Fab′，自由巯基与马来酰亚胺活化 HRP 反应，偶联比严格 1:1。过量 HRP 会导致空间位阻，反而降低催化效率。每批酶标抗体用 ABTS 快速测活性，比活性 ≥ 450 U/mg 才能放行，低于此值曲线平台区下沉 8 %。

标准品溯源：WHO 73/601 一级校准，赋值不确定度 2.8 %

冻干标准品溶于 6 M 盐酸胍破坏结合蛋白，再用 0.02 % BSA PBS 稀释成 0–200 ng/mL 七点梯度。扩展不确定度 k=2 时 2.8 %，期刊投稿可直接引用。无 WHO 代码的“内部校准”常被审稿人要求重测。

竞争抑制副反应：CA125、CA19-9 5000 U/mL 回算 < 0.2 ng/mL

CEA 与 CA125 同属黏蛋白家族，交叉反应必须提前阻断。12C6 负向吸附 CA125 5000 U/mL 后，ELISA 回算值 < 0.2 ng/mL，临床高 CA125 卵巢癌样本不会假性抬高 CEA，避免肿瘤监测出现“假进展”。

显色动力学：TMB 12 min 线性区间，早停 30 s 差 3 %

HRP 催化 TMB 呈 S 曲线，8–12 min 处于线性段。设定 12 min 锁死，误差 ±5 s，OD 差 0.02，相当于 2 ng/mL 浓度差。计时器蜂鸣后统一加 2 M H?SO?，终止反应，把人为误差压到最低。

曲线拟合：五参数 logistic 解决平台区“肩峰”

CEA 夹心曲线在 150 ng/mL 出现轻微肩峰，四参数强行拉平会把 100 ng/mL 样本压低 4 %。启用 5PL，让 asymmetry 因子 0.8–0.9 自由浮动，回算偏差 ≤ 2 %，满足 NACB 对肿瘤标志物偏差 ≤ 5 % 要求。

背景控制：空白孔 OD ≤ 0.05，靠洗板机负压 ?150 mbar

空白孔 OD 0.08 时，0 ng/mL 标准品 OD 从 0.15 升到 0.20，低值样本直接被“抬”进 2 ng/mL 灰区。洗板机抽吸负压 ?150 mbar，注液 350 μL × 4 次，残留体积 < 1 μL，空白 OD 稳稳 ≤ 0.05。

高值钩状区：> 1000 ng/mL 才出现假低值

夹心法钩状点由捕获/检测比例决定。试剂盒把捕获量降到 0.6 μg/mL，检测抗体 1∶3000，钩状点推到 1000 ng/mL，高于临床可见峰值。验收时加标 800 ng/mL，回算值应在靶值 ± 8 %，避免肝癌高值样本假低。