预读板：空板 OD 450 nm ≤ 0.08 才能开始

预包被板从 4 ℃ 取出，常温平衡 30 min 后空读一次。任何一孔 OD > 0.08 说明抗体层受潮解吸，背景会抬高 0.03–0.05，低值样本直接被淹没。发现超标立即整袋退货，拍照留档，避免后续数据异常找不到源头。

标准品复溶：100 μL 慢吸慢放，气泡 = 浓度掉

冻干标准品含 0.02 % Tween-20，剧烈吹打产生气泡，2 h 后浓度掉 3 %。用 100 μL 移液器贴壁慢放，再漩涡 3 s–停 2 s 循环 5 次，肉眼无气泡，0 h 与 2 h 测定差 < 0.5 %，符合 EP18 要求。

样本处理：血清 1 h 内离心 3000 g × 10 min，溶血 < 2 %

溶血释放红细胞 PD-L1 片段，OD 抬高 0.02–0.03，相当于 5 pg/mL 假值。离心后血红蛋白 ≤ 100 mg/L 肉眼不可见，用分光光度计 414 nm 吸光度 < 0.25 判定合格。溶血超标样本直接退单，避免临床误判免疫逃逸。

加样顺序：先加样后加酶，间隔 ≤ 5 min

采用双抗体夹心，先加样 50 μL，再加酶标检测抗体 50 μL，间隔 > 5 min 会导致前 3 排与后 3 排处于不同反应起点，板内 CV 从 4 % 升到 8 %。用 8 通道移液器，样与酶同批吸放，把间隔压到 1 min，CV 稳稳 ≤ 4 %。

洗板机设定：注液 350 μL，残留 < 1 μL

竞争法怕游离酶，夹心法更怕抗体残留。设定 350 μL 注液，抽吸 ?150 mbar，洗 4 次，残留体积 < 1 μL。每月用 0.1 % 孔雀绿测残留，任何一孔 ≥ 2 μL 立即拆洗头，用 1 % 次氯酸钠浸泡 15 min，背景 OD 从 0.12 降回 0.04。

孵育温控：37 ℃ ± 0.3 ℃，四角放芯片实时记录

PD-L1 抗体对温度斜率 2 %/℃，四角掉 0.5 ℃ 就能把 50 pg/mL 样本压到 47 pg/mL。用金属浴四角贴无线探头，低于 36.7 ℃ 手机报警，及时调整。季度导出温度曲线，CAP 评审直接放行。

显色时间：12 min 锁死，误差 ± 5 s

TMB 底物 12 min 时 650 pg 标准孔 OD 1.2 左右，窗口最佳。时间漂移 30 s，OD 差 0.03，相当于 8 pg 浓度差。用计时器蜂鸣，统一加终止液，把人为误差压到 5 s 以内，低值样本复测率从 5 % 降到 1 %。

曲线拟合：五参数 logistic， asymmetry 因子 0.85–0.95

PD-L1 夹心曲线底部有轻微上翘，四参数强行拉平会把 10 pg/mL 样本抬升 5 %。启用 5PL，让 asymmetry 自由浮动 0.85–0.95，低值回算偏差 ≤ 2 %。软件默认锁四参数，实验员需手动勾选 5PL，并验证 15 pg/mL 质控在靶。

报告审核：自动标志 > 15 % CV 的孔

Excel 模板设条件格式，任何孔 CV > 15 % 自动标红，复查是否气泡、吸液不足。每月统计红旗孔比例，> 2 % 就重新培训移液手法，把人为失误压到最低。