IgG 在血清里占 7–10 mg/mL，浓度比细胞因子高一万倍，信号却容易“顶天”。把 Mouse IgG ELISA Kit 拆成 5 段反应链，每段给出抗体亲和常数、检测上限与误差来源，看完就知道高背景从哪来、该怎么锁范围。

1. 包被阶段：山羊抗小鼠 IgG Fc 片段亲和常数 2×10^9 M?1

厂商用 pH 9.6 碳酸盐缓冲液把捕获抗体固定在微孔板，4 ℃ 过夜。

关键数字：

• 每孔包被量 0.75 μg，对应 5×10^12 个结合位点，远超 100 ng 样本 IgG，确保钩状效应出现在 50 μg/mL 而非 5 μg/mL。
• 亲和常数 2×10^9 M?1 保证解离率 k_off 0.0005 s?1，洗板 5 次损失 <1 %。

2. 封闭阶段：酪蛋白把剩余疏水位点填满

BSA 便宜但含 IgG 污染，酪蛋白纯度 ≥95 %，封闭后非特异结合可降到 0.02 OD。

操作节点：200 μL/well，室温 120 min，湿度 60 % 以上防止边缘蒸发。封闭液里加 0.05 % Tween-20，能把疏水吸附再降 30 %。

3. 样本结合：液相 IgG 与固相抗体碰撞频率 3×10^4 s?1

100 μL 样本加入后，IgG 浓度 1 μg/mL 时，理论碰撞次数 3×10^4 s?1，结合反应 30 min 达到 90 % 平衡。

误差来源：

• 红细胞裂解释放血红蛋白，在 405 nm 吸收峰与 HRP-TMB 重叠，造成正偏差 5 %–8 %。
• 血脂 >3 % 时形成乳糜微粒，IgG 被包裹，有效浓度下降 12 %，结果偏低。

4. 检测抗体：HRP-山羊抗小鼠 IgG 全程 F(ab’)? 片段

F(ab’)? 去掉 Fc 后不与类风湿因子结合，RF-IgG 复合物假阳性从 0.08 OD 降到 0.01 OD。

工作浓度：0.25 μg/mL，对应摩尔浓度 1.7 nM，与样本 IgG 形成 1:1 夹心，检测上限锁在 50 μg/mL，超过即进入 Hook 平台。

5. 显色反应：TMB 转化率 0.45 AU·ng?1·min?1

HRP 催化 TMB 的米氏常数 K_m 0.18 mM，试剂盒 TMB 浓度 0.4 mM 属于饱和底物。

线性区间：

• 0–3 ng HRP 对应 0–2.0 AU，R2 0.999。
• 12 min 显色后 1 AU≈1.25 μg/mL IgG，换算系数印在 COA 第三页，批次间差异 <4 %。

6. 背景信号拆解：空白孔 0.035 AU 从哪来？

• 板底自身吸光 0.015 AU
• TMB 微量自发氧化 0.010 AU
• 亲和素残留 0.006 AU
• 封闭剂吸光 0.004 AU

总空白 0.035 AU 是行业均值，超过 0.05 AU 说明封闭失败或洗板不彻底，整批数据应弃用。

7. 一步法 vs 两步法：速度换灵敏度

一步法把样本与 HRP 抗体同时加入，孵育 45 min 完成，适合高通量筛选，检测限 30 ng/mL。

两步法先样本 60 min 再检测 60 min，背景更低，检测限 3 ng/mL，适合血清 IgG 亚类测定。

8. 反应链误差传递表

把每段误差锁在表格范围内，总不确定度可压到 6 % 以内，符合 ELISA 定量标准 ISO/TS 21003。