01 免疫识别：单克隆对 3 维表位像锁匙一样卡死

IL-5 是同源二聚体，两个链由二硫键 Cys44–Cys86 锁住。

捕获抗体克隆 TRFK5 识别位点在 α 螺旋 A 段 28–39 aa，亲和力 3.4 × 10?1? M。

检测抗体克隆 16H8 结合位点在螺旋 C 段 102–115 aa，与 TRFK5 空间距离 4.2 nm，形成 1:2 三明治，避免空间位阻。

抗体对经过肽库扫描，与 IL-3、GM-CSF 交叉 < 0.05 %，保证信号来自 IL-5 且只来自 IL-5。

02 信号放大：HRP 底物选择决定线性段长短

TMB 显色动力学分两相：

• 0–10 min 吸光度与 IL-5 浓度呈直线，斜率 0.0028 OD·pg?1·mL
• 10 min 后产物抑制酶活，曲线肩部提前

把显色时间锁在 8 min，终止液 1 M H?PO? 50 μL，线性上限从 1 000 pg/mL 提到 1 500 pg/mL，省一次稀释。

高浓度样本若超 1 500 pg/mL，用 0.3 M 硫酸终止，产物在 450 nm 摩尔消光系数降到 80 %，自动把 OD 拉回线性区，无需再稀释。

03 背景控制：链霉亲和素批次差异 5 % 如何归零

96 孔板预包被链霉亲和素，不同批次活性差异 5 %，直接抬高背景 0.008 OD。

厂家在缓冲液里加 0.5 % PEG-8000，占位羟基减少非特异吸附，背景降到 0.003 OD。

用户侧再加 0.01 % Tween-20 洗液，背景再削 0.001 OD，零孔 CV 稳在 3 % 以内。

把背景值写进原始记录，审稿人质疑灵敏度时直接甩原始 OD，一次通过。

04 能量换算：把 OD 值翻译成 pg/mL 的 3 个系数

四参数拟合公式里 A、B、C、D 四值对应板能量效率：

• A 底平台 0.042 OD，代表本底
• D 顶平台 2.8 OD，代表酶最大转换
• C 即 EC50 68 pg/mL，代表抗体亲和力
• B 斜率 1.05，代表酶催化协同度

同一台酶标仪，光源能量衰减 10 %，D 值掉到 2.5 OD，EC50 漂到 75 pg/mL。

用 QC 样本 250 pg/mL 做校正因子 CF = 理论 OD / 实测 OD，所有样本浓度乘以 CF，板间差从 12 % 拉回 4 %。

CF 每月更新一次，写入 Excel 模板，拖入原始数据 3 秒完成修正，无需重新标曲。

05 竞争干扰：嗜异性抗体阻断剂浓度 50 μg/mL 就够

小鼠血清里抗鼠 Ig 抗体滴度 1:100–1:400，容易桥接捕获与检测抗体，假阳性 30–50 pg/mL。

厂家配 HeteroBlock 2 mg/mL，按 1:40 稀释成 50 μg/mL 加入样本稀释液，干扰降到 2 pg/mL 以下。

阻断剂含鼠 IgG、鼠血清蛋白，浓度再高反而抑制真阳性信号，50 μg/mL 是拐点，R&D 与 KET7008 说明书都写 50 μg/mL，照抄即可。

06 反应温度：25 °C 水浴 vs 37 °C 空气浴的速率差

25 °C 孵育 2 h 达到平衡，37 °C 1 h 就能平衡，但 37 °C 蒸发速率 1.2 μL/min，边缘孔体积减少 6 %，CV 涨到 8 %。

选 25 °C 水浴，水面贴封板膜，蒸发 < 0.1 μL，整板 CV 稳在 4 %。

水浴箱里放一块带孔铝板，ELISA 板嵌入后上缘高出水面 2 mm，封板膜不被水浸湿，既恒温又防潮，一次买 10 块铝模，成本 80 元，用到设备报废。

07 读数路径：双波长 450/630 nm 的真实意义

630 nm 是参比，用来扣塑料板本身吸光度。

板底划痕、指纹、气泡在 630 nm 有信号，扣减后能把空白 OD 从 0.06 压到 0.03。

气泡在 450 nm 读 0.08，在 630 nm 读 0.05，差值 0.03 仍然留在结果里。

读数前 30 s 把板 1 000 rpm 轻甩 10 s，气泡破裂，450 nm 信号降 0.02，数据直接合格，省去重复读板。