复苏：90 秒水浴与 24 小时静养

冻存管从液氮取出后，37 °C 水浴精确计时 90 秒，管中冰晶刚好消失即可。提前在 15 mL 离心管里预置 9 mL 完全培养基，细胞悬液沿管壁缓慢滴入，边滴边轻摇，稀释 DMSO 毒性。800 rpm 离心 3 分钟，弃上清，轻弹管底打散沉淀，再加入 6 mL 新鲜培养基，转入 T-25 培养瓶，前 24 小时不移动、不观察，让细胞从应激中恢复。

铺板密度：3×10? cells/cm2 黄金值

3359 细胞贴壁后伸展快，密度过低会触发应激性衰老，过高则 48 小时内出现接触抑制。经验公式：每平方厘米 3×10? cells，T-25 瓶约 7.5×10? cells，既保证 24 h 汇片率 30 %，又给后续实验留出 2–3 代扩增空间。悬浮计数后用台盼蓝确认活率 ≥90 %，再按计算体积接种，避免二次离心。

换液节奏：隔日半量替换

3359 细胞分泌大量 IL-6 与 VEGF，48 h 内培养基颜色由红转橙，pH 降至 6.9。采用半量换液：每次吸出 50 % 旧液，补入等体积预热培养基，既稀释代谢废物，又保留自分泌因子。全量换液需提前 2 h 将培养基放入培养箱预平衡 CO?，避免 pH 冲击。

消化技巧：0.05 % Trypsin-EDTA 37 °C 60 秒

3359 表达高量 CD90，膜蛋白丰富，对胰酶敏感。预热 0.05 % Trypsin-EDTA 至 37 °C，覆盖瓶底后计时 60 秒，轻拍瓶壁即见细胞成流沙状。立即加入 2 倍体积含血清培养基终止，离心 800 rpm 3 分钟。过度消化会导致膜蛋白脱落，下游流式检测 CD90 阳性率下降 10 % 以上。

传代标记：P 数与 PD 数双轨记录

实验记录同时写入瓶身与电子系统：P 数为复苏后传代次数；PD 数（群体倍增）按公式 PD = log?(Nt/N0) 计算。3359 细胞每代约 2.2 PD，P10 对应 PD≈22。期刊投稿常要求 PD 而非 P 数，双轨记录避免返工。

冻存回退：梯度降温盒替代程序降温仪

将冻存管放入预冷梯度降温盒，-80 °C 静置 4 h，再移入液氮。盒内异丙醇每使用 5 次更换一次，防止降温速率漂移。复苏后存活率与程序降温仪无差异，成本降低 80 %。

共培养启动：Transwell 0.4 μm 孔径

3359 细胞用作胰腺癌细胞 CAF 模型时，采用 0.4 μm 孔径 Transwell，防止细胞穿膜但允许分泌因子交换。上室铺 2×10? 3359，下室 5×103 癌细胞，48 h 后收集下室上清检测 α-SMA、IL-6、Collagen I 表达，数据重复 3 次 CV<8 %。

污染急救：72 小时抗生素梯度清除

发现支原体污染，立即将细胞转入 10 μg/mL Plasmocin 培养基，第 3 天降至 5 μg/mL，第 5 天降至 2.5 μg/mL，第 7 天停药。停药后连续 3 代荧光法检测阴性方可解除隔离。期间禁止与其他细胞共用培养箱，防止交叉污染。

实验暂停：短期休眠 4 °C 过夜

实验中断 <24 h，可将培养瓶置于 4 °C 冰箱，细胞代谢降至 5 %，复苏后 6 h 内恢复增殖。超过 24 h 直接冻存，避免 pH 失控导致不可逆损伤。