日常培养巡检

每天固定时段观察细胞形态与培养基颜色。微血管内皮细胞呈鹅卵石单层，一旦局部出现拉丝、脱落，预示基质缺胶或血清批次差异。立即补加 0.1 % gelatin 重新包被，并换用同一批号 FBS。

支原体污染排查

每两周取 1 mL 上清，用 Hoechst 33258 直接染色，荧光显微镜下无细胞外亮点方算合格。若出现疑似荧光碎片，立刻执行“三日封锁”：丢弃全部培养瓶，0.5 % 次氯酸钠浸泡 30 min，培养箱 37 ℃ 空转 24 h 并更换 CO? 滤芯。

培养基配方优化

长期传代后，细胞对 VEGF 需求下降。可把 VEGF-165 浓度由 50 ng/mL 梯度降至 10 ng/mL，每降一档观察一次倍增时间，确保仍 ≤20 h。若倍增时间延长，同步检测 FGF-2 活性，必要时补充 5 ng/mL 重新拉回生长曲线。

冻存库维护

液氮罐分区标记：主库（P10-P20）、工作库（P21-P30）、备份库（P31 以上）。每次取管后 30 s 内完成液氮回填，避免温度震荡。半年一次罐口温度监测，记录值高于 -150 ℃ 立即安排补液氮并排查密封圈。

复苏后早期干预

复苏 6 h 内贴壁率 <80 %，执行“二次贴壁”：把悬浮细胞离心收集，重悬于含 20 % FBS 的完全培养基，重新铺板到 0.2 % gelatin 包被皿。12 h 后再次计数，通常可拉回 15 % 活性损失。

长期代数管理

使用电子表格追踪每瓶传代日期、代数与累积倍增次数。设定警戒线：累积倍增 120 次或代数 >P40 即淘汰。淘汰前留 3 管冻存，标记“终代备份”，确保实验回溯。

设备与环境校准

CO? 探头每季度用 5 % 标准气校正，误差 >0.2 % 立即更换。培养箱湿度探头以饱和盐水法每月验证一次，读数低于 90 % 时检查水盘密封条。

记录与溯源

建立唯一批次二维码，扫码即可查看培养基批号、血清批次、支原体检测结果、冻存记录。所有纸质记录拍照上传云端，防止纸质档案丢失造成数据断层。