一、细胞系简介

永生化大鼠视网膜Muller细胞系-SV40T是一种重要的视网膜研究模型。它通过SV40T抗原基因的引入，实现了细胞的永生化，可在体外长期稳定培养，为视网膜疾病机制探究、药物筛选等研究提供了有力工具。

二、培养基配制

基础培养基选用DMEM/F12混合基，按体积比1:1混合，满足细胞基本营养需求。添加10%胎牛血清，提供细胞生长必需的生长因子、激素等营养成分，促进细胞增殖与代谢。加入2% B27添加剂，补充维生素、矿物质等微量营养物质，维持细胞生理功能稳定。加入1%青霉素-链霉素溶液，防止细菌、真菌污染，保障细胞培养环境清洁。

三、细胞传代操作

观察细胞生长状态，当细胞汇合度达70%-80%时，进行传代处理。弃去旧培养基，用PBS轻轻冲洗细胞两次，去除残留培养基及代谢废物。加入0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液，37℃孵育2-3分钟，使细胞间连接松散。在显微镜下观察，当细胞边缘略微卷曲、细胞间隙增大时，迅速加入含有血清的培养基终止消化，防止细胞过度消化受损。用移液枪轻轻吹打细胞，使其从培养皿表面脱落，形成均匀的细胞悬液。按1:2或1:3比例将细胞悬液分配至新的培养皿中，加入新鲜培养基，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布。置于37℃、5% CO?培养箱中培养，定期更换培养基，观察细胞生长情况。

四、细胞冻存与复苏

冻存时，将细胞收集至离心管中，用冻存液（含10% DMSO的完全培养基）重悬细胞，调整细胞密度至1×10^6个/mL。将细胞悬液分装至冻存管中，每管1mL。放入程序降温盒中，-80℃预冻2小时，然后转移至液氮罐长期保存。复苏时，从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37℃水浴中快速解冻，轻轻晃动冻存管，使细胞均匀受热，避免局部过热损伤细胞。解冻后，立即将细胞悬液转移至含有9mL完全培养基的离心管中，离心1000rpm，5分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种至培养皿中，37℃、5% CO?培养箱中培养，观察细胞复苏后生长状态，及时更换培养基，促进细胞恢复生长。

五、常见问题与解决方案

细胞培养过程中易出现生长缓慢问题，可能是培养基营养不足、血清质量差或细胞传代次数过多、活力下降导致。此时需更换高质量培养基与血清，若细胞传代超15代，建议丢弃老细胞，启用新细胞系。细胞污染也是常见难题，细菌污染使培养基变浑浊、pH下降；真菌污染则见培养基表面现丝状物或斑点。一旦发现污染，立即丢弃污染细胞与培养基，对培养器具、操作环境严格消毒，防止污染扩散。后续操作加强无菌意识，采用无菌操作规范，如酒精擦拭操作台、使用无菌移液器等，降低污染风险。