永生化MS-/-小鼠肺泡巨噬细胞（ZK2）是研究肺部免疫机制、炎症反应及疾病模型的有力工具。这类细胞被赋予了永生化特性，能够在体外无限增殖，同时保留了肺泡巨噬细胞的许多功能特性，包括吞噬能力、炎症因子分泌等。它在研究肺部感染、免疫调节、炎症机制等方面具有重要应用价值。

一、培养基配制

ZK2细胞的培养通常使用 RPMI-1640 培养基作为基础。RPMI-1640 是一种广泛用于悬浮及贴壁细胞系的培养基，具有良好的缓冲能力和营养成分。为满足 ZK2 细胞的特殊需求，需要对基础培养基进行以下补充：

• 添加 10% 胎牛血清（FBS），提供细胞生长所需的营养物质和生长因子。
• 加入 1% 青霉素-链霉素溶液（P/S），用于防止细菌和真菌污染。
• 根据需求，可以通过添加 1% L-谷氨酰胺和 0.1% β-巯基乙醇来优化培养条件。

配制好的培养基需在 4℃下保存，避免反复冻融。

二、培养条件

ZK2细胞在标准的细胞培养条件下进行培养：

• 温度：37℃
• 气体环境：5% CO? 和 95% 空气的混合气体，用于维持培养基的 pH 值稳定。
• 培养容器：建议使用透气性良好、无毒的培养瓶或培养皿。若实验需要细胞贴壁生长，可以选择预先包被有胶原蛋白或纤维连接蛋白的培养表面。

培养过程中应定期更换培养基（每1-2天一次），以确保营养充足并维持适宜的生长环境。

三、细胞的传代

ZK2细胞在生长至培养容器表面的 80%-90% 汇合度时，即可进行传代操作。以下是详细的传代步骤：

1. 洗涤细胞：使用无菌的 PBS 洗涤细胞 2-3 次，以去除培养基中的血清成分。
2. 消化细胞：加入适量的 0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 消化液，在 37℃下孵育 1-2 分钟。注意避免过度消化，以免损伤细胞。
3. 终止消化：在显微镜下观察细胞脱落情况后，加入含胎牛血清的培养基终止消化。
4. 吹打重悬：用吸管轻轻吹打细胞，使其分散成均匀的单细胞悬液。
5. 分装培养：按照 1:2 或 1:3 的比例将细胞悬液分装到新的培养容器中，加入新鲜培养基后继续培养。

传代后的细胞需静置 24 小时，让其恢复贴壁状态，避免频繁扰动。

四、细胞的冻存与复苏

细胞的冻存

对于长期保存，冻存细胞是常见方法。冻存操作如下：

1. 制备冻存液：使用含有 10% DMSO 和 90% 胎牛血清的冻存液，确保细胞在低温下存活率高。
2. 收集细胞：用胰蛋白酶消化细胞，制备成单细胞悬液后，用冻存液重悬，调整细胞密度至 5×10? - 1×10? cells/ml。
3. 分装与降温：将细胞悬液分装到冻存管，每管 1-1.5 ml。将冻存管放入程序降温盒，置于 -80℃冰箱过夜，次日转移至液氮罐保存。

细胞的复苏

从液氮中复苏细胞时，操作需迅速：

1. 解冻：将冻存管取出后，迅速放入 37℃水浴中解冻，同时不停摇晃以确保均匀受热。
2. 稀释与培养：解冻后立即用新鲜培养基稀释细胞悬液，轻轻吹打后转移至培养容器，加入含血清的培养基，静置培养。
3. 环境稳定：复苏初期避免频繁扰动，让细胞有足够时间恢复活力。

五、常见问题及解决方案

细胞污染

ZK2 细胞的培养过程中，污染是常见问题。污染可能来源于培养基、无菌操作不当或环境中的细菌、真菌等微生物。解决方法包括：

• 使用高质量的无菌试剂和培养基。
• 操作时严格遵循无菌操作规范。
• 定期检查培养环境，确保清洁。

细胞生长缓慢

可能的原因包括培养基营养不足、细胞密度过高或过低、环境不稳定等。可以尝试以下方法：

• 检查培养基的新鲜度，必要时更换新的培养基。
• 调整细胞接种密度，避免密度过高或过低。
• 稳定培养箱的温湿度及 CO? 浓度。

细胞形态异常

细胞形态异常可能提示细胞受到应激或损伤，原因包括消化时间过长、培养条件不稳定等。预防措施包括：

• 优化胰蛋白酶的消化时间，避免过度处理。
• 稳定培养环境，避免频繁扰动细胞。