一、细胞特性及应用

永生化人食管上皮细胞（NE2-hTERT）是一种通过 hTERT（人端粒酶逆转录酶）基因转染获得的永生化细胞系。这种细胞系保留了正常食管上皮细胞的许多特性，同时具备无限增殖的能力。它在食管疾病研究、药物筛选以及细胞生物学研究中具有重要应用价值。例如，可用于研究食管癌的发生机制、评估抗肿瘤药物的疗效等。

二、培养基的配制

选择合适的培养基是成功培养 NE2-hTERT 细胞的关键。通常使用以下培养基成分：

• 基础培养基：Keratinocyte Serum-Free Medium（K-SFM）或 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）
• 添加成分：
  • 5% 胎牛血清（FBS）
  • 1% 青霉素-链霉素溶液（Penicillin-Streptomycin）
  • 0.5 ng/mL 表皮生长因子（EGF）
  • 5 μg/mL 胰岛素
  • 0.1 mM 氯化胆碱
  • 0.4 μg/mL 氢化可的松

配制时，需确保所有成分新鲜且无菌，避免污染。将上述成分按比例混合，并调节 pH 至 7.2-7.4，即可用于细胞培养。

三、培养条件

（一）温度和气体环境

NE2-hTERT 细胞应在 37℃、5% CO? 的培养箱中培养。CO? 的作用是维持培养基的 pH 稳定。培养箱内的湿度应保持在 95% 以上，以防止培养基过度蒸发。

（二）培养容器

选择透气性好、无毒且表面经过处理的培养皿或培养瓶。在使用前，用 75% 的酒精对培养容器进行消毒，并在超净工作台内进行操作，降低污染风险。

四、细胞的接种与传代

（一）细胞的接种

根据实验需求，确定合适的细胞接种密度。一般来说，NE2-hTERT 细胞的接种密度可在 5×103 - 1×10? cells/cm2 之间。将细胞悬液均匀地接种到培养容器中，确保细胞分布均匀。

（二）原代培养

将接种好的培养容器放入培养箱中培养。培养初期，细胞可能会经历一个滞后期，生长速度较慢。此时应保持培养环境的稳定，避免频繁扰动细胞。定期观察细胞的生长状态，如细胞的形态、颜色以及是否有污染迹象等。

（三）细胞的传代

当细胞生长至培养容器表面的 80% - 90% 汇合时，即可进行传代操作：

1. 用无菌的 PBS 洗涤细胞 2 - 3 次。
2. 加入适量的 0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 溶液，在 37℃下孵育 1 - 2 分钟。
3. 在显微镜下观察细胞的脱落情况，避免过度消化。
4. 加入含血清的培养基终止消化，轻吹打制成均匀的细胞悬液。
5. 按照 1:2 - 1:3 的比例将细胞悬液分装到新的培养容器中，加入新鲜培养基继续培养。

五、细胞的冻存与复苏

（一）细胞的冻存

1. 在冻存前，确保细胞处于良好的生长状态，无污染。
2. 用胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。
3. 按照 5×10? - 1×10? cells/ml 的浓度将细胞悬液与冻存液（含 10% DMSO 的 FBS）混合。
4. 将混合好的细胞悬液分装到冻存管中，每个冻存管装 1 - 1.5 ml。
5. 使用程序降温盒将冻存管放入 -80℃冰箱过夜，第二天转移到液氮罐中保存。

（二）细胞的复苏

1. 从液氮中取出冻存管，迅速放入 37℃水浴中快速解冻。
2. 解冻后的细胞立即用新鲜培养基稀释并轻轻吹打混匀。
3. 将细胞悬液转移到培养容器中，加入适量培养基，轻轻晃动使细胞均匀分布。
4. 将培养容器放入 37℃、5% CO? 的培养箱中静置培养，24 小时内避免频繁操作。

六、常见问题及解决方案

（一）细胞污染

细胞污染主要来源于培养基、试剂、培养容器以及操作过程中的空气。一旦发现细胞受到细菌、真菌或支原体等污染，应立即停止培养并处理。预防措施包括严格无菌操作、定期对培养环境和试剂消毒等。

（二）细胞生长缓慢

细胞生长缓慢可能由培养基营养不足、细胞密度过高或过低、培养环境不稳定等原因引起。解决方法包括检查培养基质量、调整细胞接种密度、保持培养环境稳定等。

（三）细胞形态异常

细胞形态异常可能提示细胞受到应激、损伤或发生了恶性转化。这可能与培养条件改变、传代次数过多、病毒感染等因素有关。应密切观察细胞形态变化，检查培养条件是否符合要求，确保传代次数在合理范围内，并及时处理受病毒感染的细胞。