在细胞研究领域，永生化人滋养层细胞 - hTERT (Sw.71) 是一种极具价值的细胞模型，广泛应用于胎盘生物学、生殖医学和肿瘤学等研究。本文将聚焦于该细胞的操作使用，提供详细且实用的细胞培养全流程指南。

一、细胞培养前的准备

（一）培养材料的精准选择与准备

培养基是细胞生长的“土壤”，其质量直接影响细胞的生长状态。对于永生化人滋养层细胞 - hTERT (Sw.71)，推荐使用 DMEM/F12 或 RPMI 1640 培养基。这些培养基富含细胞生长所需的营养成分，如氨基酸、维生素、矿物质等，为细胞提供全面的营养支持。

培养容器的选择同样重要。通常，使用组织培养处理过的塑料培养皿或培养瓶，其表面经过特殊处理，有利于细胞的贴壁和生长。在使用前，需对培养容器进行严格的清洗和消毒，确保无菌无污染。

血清是培养基的重要补充成分，通常添加 10% - 15% 的胎牛血清。血清中含有丰富的生长因子、细胞黏附因子和营养成分，如胰岛素、转铁蛋白等，能够促进细胞的贴壁、增殖和分化。同时，血清还能提供一些未知的生物活性物质，有助于维持细胞的正常生理功能。

此外，根据细胞的生长特性和实验需求，添加特定的生长因子和添加剂也至关重要。例如，表皮生长因子（EGF）能够刺激细胞的增殖，促进细胞周期的 progression；氢化可的松可以调节细胞的分化和功能，增强细胞的稳定性。

（二）人员的卫生管理

操作人员是细胞培养过程中的潜在污染源之一，因此要重视个人卫生和操作规范。在进行细胞操作前，要彻底洗净双手，并戴上无菌手套，避免手上的细菌和微生物接触到细胞或培养基。同时，要穿着干净的实验服，佩戴口罩和帽子，防止头发和口鼻中的微生物污染细胞。操作过程中，动作要轻柔、迅速，减少细胞暴露在外界环境中的时间，降低细胞受到污染的可能性。

二、细胞培养中的技术要点

（一）细胞复苏的精细操作

从液氮罐中取出冻存的细胞后，需立即将其放入 37℃的水浴中快速解冻。水浴的温度要严格控制，过高会导致细胞受热不均，引起细胞膜结构的破坏；过低则会使解冻速度过慢，细胞内部形成冰晶，损伤细胞内的细胞器。快速解冻能确保细胞内外温度均衡上升，减少细胞内冰晶的生成和细胞的损伤，使细胞在短时间内恢复到正常状态。

解冻后的细胞经过离心去除冻存液后，要用新鲜培养基进行重悬，然后置于细胞培养箱中进行培养。培养箱的温度、湿度和气体环境要精确调节，一般温度为 37℃，湿度保持在 95% 以上，气体环境为 5% 二氧化碳和 95% 空气。细胞在复苏后的最初 24 - 48 小时内，生长状态较为脆弱，需要密切观察细胞的形态和生长情况，必要时更换培养基，以确保细胞顺利适应培养环境，恢复正常的生长代谢。

（二）细胞培养的环境控制

永生化人滋养层细胞 - hTERT (Sw.71) 对培养环境的要求较高。培养箱的温度、湿度和气体环境需要严格控制。温度的精确控制可以确保细胞的酶活性和代谢过程处于最佳状态；二氧化碳的作用是维持培养基的 pH 值稳定，防止细胞受到酸碱度变化的影响。此外，定期更换培养基也是维持细胞良好生长状态的关键。一般每 2 - 3 天更换一次培养基，以确保细胞始终处于营养充足、代谢废物少的环境中。

（三）细胞传代的规范操作

当细胞生长至 80% - 90% 汇合度时，可以进行传代操作。传代时，使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液进行消化，消化时间一般控制在 1 - 2 分钟，避免过度消化对细胞造成损伤。将消化后的细胞轻轻吹打制成单细胞悬液，按 1 : 3 或 1 : 4 的比例进行稀释，接种到新的培养皿中，并加入适量的培养基，使细胞能够在新的环境中继续生长。

（四）细胞污染的防治

细胞污染是细胞培养中的常见问题，它会严重影响细胞的生长和实验结果的准确性。培养箱要定期进行清洁和消毒，去除内部的灰尘和细菌，一般每两周使用 75% 的酒精擦拭培养箱内壁，并开启培养箱的高温灭菌功能进行灭菌。超净工作台在使用前要提前开启，让其运行一段时间，以净化空气，确保在细胞操作过程中有一个无菌的环境。培养基则要严格控制保存条件，一般在 4℃保存，且在有效期内使用，避免培养基被污染或变质。

三、细胞培养后的处理

（一）细胞的冻存操作

当实验需要长期保存细胞时，需进行细胞冻存操作。冻存液由基础培养基、胎牛血清和冷冻保护剂组成，一般按照体积比 5 : 3 : 2 进行配置。将细胞从培养皿中轻轻消化并制成细胞悬液，用冻存液按合适的比例进行稀释，将细胞浓度调整至 1×10^6 - 5×10^6 个 / mL。将混合后的细胞悬液分装至冻存管中，每管装液量约为 1 - 1.5 mL。随后，将冻存管置于 - 80℃的冰箱中，一般需要经过 24 - 48 小时的冷冻过程，使细胞充分适应低温环境，降低代谢速度，同时减少细胞内水分的冰晶形成，从而降低细胞受到的冻存损伤。

（二）细胞的收集与保存

在实验结束后，需要对细胞进行收集和保存。对于贴壁细胞，首先用 PBS 缓冲液轻轻冲洗培养皿，去除残留的培养基和未贴壁的细胞。然后加入适量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液，消化细胞使其从培养皿表面脱落。将消化后的细胞悬液收集到离心管中，离心去除消化液，用新鲜培养基或 PBS 缓冲液重悬细胞，按实验需求进行后续处理或保存。对于悬浮细胞，直接收集培养液中的细胞，离心去除培养基，同样用新鲜培养基或 PBS 缓冲液重悬细胞，进行后续处理或保存。保存时，可根据实验需要选择合适的保存条件，如 4℃短期保存或 - 80℃长期保存。