在细胞培养领域，永生化人骨髓间充质干细胞备受关注，因其在再生医学、药物筛选和疾病研究等方面展现出巨大潜力。为助力科研工作者高效开展相关研究，本文聚焦于永生化人骨髓间充质干细胞的操作使用，提供全面且实用的培养全流程管理建议。

一、细胞冻存的黄金法则

细胞冻存是细胞培养过程中的关键环节，目的是在极低温度下保持细胞的活性和特性，以备后续使用。

（一）冻存液的精准配置

冻存液由基础培养基、胎牛血清和冷冻保护剂组成，一般按照体积比 5 : 3 : 2 进行配置。基础培养基为细胞提供基本的营养成分，维持细胞的代谢活性；胎牛血清富含多种营养物质和细胞生长因子，有助于维持细胞的稳定状态；冷冻保护剂通常选用甘油或二甲基亚砜（DMSO），它们能够降低细胞内水分的冰点，减少细胞内冰晶的形成，从而降低细胞在冻存过程中受到的损伤。

（二）冻存操作的精细流程

将细胞冻存至 - 80℃是关键步骤之一。首先需将细胞从培养皿中轻轻消化并制成细胞悬液，用冻存液按合适的比例进行稀释，将细胞浓度调整至 1×10^6 - 5×10^6 个 / mL。将混合后的细胞悬液分装至冻存管中，每管装液量约为 1 - 1.5 mL。随后，将冻存管置于 - 80℃的冰箱中，一般需要经过 24 - 48 小时的冷冻过程，使细胞充分适应低温环境，降低代谢速度，同时减少细胞内水分的冰晶形成，从而降低细胞受到的冻存损伤。

二、细胞复苏的细腻操作

细胞复苏是将冻存的细胞快速恢复到常温并重新进入生长状态的过程，操作的精细程度直接关系到细胞的复苏成功率和活性。

（一）温度的精准调整

从 - 80℃取出冻存管后，需立即将其放入 37℃的水浴中快速解冻。水浴的温度要严格控制，过高会导致细胞受热不均，引起细胞膜结构的破坏；过低则会使解冻速度过慢，细胞内部形成冰晶，损伤细胞内的细胞器。快速解冻能确保细胞内外温度均衡上升，减少细胞内冰晶的生成和细胞的损伤，使细胞在短时间内恢复到正常状态。

（二）适应性培养的细致安排

解冻后的细胞经过离心去除冻存液后，要用新鲜培养基进行重悬，然后置于细胞培养箱中进行培养。培养箱的温度、湿度和气体环境要精确调节，一般温度为 37℃，湿度保持在 95% 以上，气体环境为 5% 二氧化碳和 95% 空气。细胞在复苏后的最初 24 - 48 小时内，生长状态较为脆弱，需要密切观察细胞的形态和生长情况，必要时更换培养基，以确保细胞顺利适应培养环境，恢复正常的生长代谢。

三、细胞污染的防治要诀

细胞污染是细胞培养中的常见问题，它会严重影响细胞的生长和实验结果的准确性，因此预防和处理细胞污染至关重要。

（一）培养环境的严格维护

细胞培养环境包括培养箱、超净工作台和培养基等。培养箱要定期进行清洁和消毒，去除内部的灰尘和细菌，一般每两周使用 75% 的酒精擦拭培养箱内壁，并开启培养箱的高温灭菌功能进行灭菌。超净工作台在使用前要提前开启，让其运行一段时间，以净化空气，确保在细胞操作过程中有一个无菌的环境。培养基则要严格控制保存条件，一般在 4℃保存，且在有效期内使用，避免培养基被污染或变质，从而降低细胞污染的风险。

（二）操作人员的卫生管理

操作人员是细胞培养过程中的潜在污染源之一，因此要重视个人卫生和操作规范。在进行细胞操作前，要彻底洗净双手，并戴上无菌手套，避免手上的细菌和微生物接触到细胞或培养基。同时，要穿着干净的实验服，佩戴口罩和帽子，防止头发和口鼻中的微生物污染细胞。操作过程中，动作要轻柔、迅速，减少细胞暴露在外界环境中的时间，降低细胞受到污染的可能性。

（三）抗生素使用的策略

合理使用抗生素是防止细胞污染的有效辅助手段。在细胞培养初期，可以在培养基中加入适量的青霉素 - 链霉素溶液，一般浓度为 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。这两种抗生素能够有效抑制革兰氏阳性和阴性细菌的生长，但长期使用可能使细胞产生耐药性，或对细胞的生长产生一定的抑制作用。因此，在细胞生长状态稳定后，应逐渐降低或停止使用抗生素，以确保细胞在正常生理环境下的生长。