cEND 细胞系的特点与优势

细胞系的建立背景

永生化小鼠脑毛细血管内皮细胞 (cEND) 细胞系的建立，旨在为血脑屏障相关的研究提供一个稳定且可靠的体外模型。该细胞系通过特定的技术手段，如使用含有 polyoma 中间 T 抗原的复制缺陷型病毒进行永生化处理，从而克服了原代细胞培养中存在寿命短、难以传代等问题，为长期的实验研究提供了可能。

细胞形态与生长特性

cEND 细胞在形态上呈现典型的铺路石样或不规则的内皮细胞样形态，具有贴壁生长的特性。在良好的培养条件下，细胞能够迅速地生长并形成致密的单层，有助于模拟体内血脑屏障的紧密结构。

细胞纯度与活性

cEND 细胞系的纯度较高，通常通过特定的分离和纯化技术获得，能够保证细胞的均一性和稳定性。细胞活性强，在适宜的培养环境中可以保持较高的增殖能力和代谢活性，为各种实验操作提供了良好的基础。

表达的特异性标记物

cEND 细胞能够表达多种脑微血管内皮细胞的特异性标记物，如 CD31、紧密连接蛋白（ZO - 1、occludin 等），这些标记物的表达有助于确认细胞的身份和功能状态，同时也为研究血脑屏障的生理和病理机制提供了重要的指标。

培养相关的技术参数

培养基的配方与优化

cEND 细胞的培养基通常以 DMEM 为基础，添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% L - 谷氨酰胺、2% MEM 套件、2% NEAA、10 ml 钠丙酮酸以及 50 U/ml 青霉素 / 链霉素等成分。这种配方能够满足细胞生长和维持其特定功能的需求。在一些研究中，为了模拟不同的生理或病理条件，还会对培养基进行优化调整，例如在低血清条件下培养以提高跨内皮电阻（TEER），或者添加氢化可的松等物质来增强细胞的屏障功能。

培养条件的控制

• 温度 ：37℃是 cEND 细胞培养的标准温度，该温度能够保证细胞的正常代谢和生长。
• 气体环境 ：细胞培养需要 5% 的 CO?和 95% 的空气混合气体环境，以维持培养基的 pH 值稳定，确保细胞的正常生理功能。

传代方法与频率

当 cEND 细胞生长至汇合状态时，即可进行传代。通常使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液进行消化，按照 1:2 至 1:4 的比例将细胞分散到新的培养容器中进行培养。在细胞状态良好的情况下，可以每周进行 1 至 2 次传代，但需注意避免过度传代导致细胞特性发生改变。

冻存与复苏的方法与要点

• 冻存 ：将细胞收集并制成单细胞悬液，加入含 5% DMSO 的冻存液中，轻轻混匀后分装于冻存管，放入 - 80℃冰箱中预冻，24 小时后转入液氮罐中长期保存。冻存过程的关键在于控制好降温速度和使用适宜的冻存保护剂，以减少细胞在冻存过程中的损伤。
• 复苏 ：从液氮中取出冻存管，迅速放入 37℃水浴中快速解冻，待细胞悬液完全解冻后，立即转移到含有适量预热培养基的离心管中，低速离心后去除上清，用新鲜培养基重悬细胞并接种到培养瓶中进行培养。复苏后的细胞需要仔细观察其生长状态，并在后续的培养过程中及时更换培养基，以帮助细胞恢复生长活力。

细胞功能与应用的技术指标

血脑屏障功能的评估指标

• 跨内皮电阻（TEER） ：TEER 是衡量血脑屏障紧密性的关键指标之一。cEND 细胞在适当的培养条件下能够形成具有较高 TEER 值的单层，TEER 值越高，说明细胞间的紧密连接越紧密，血脑屏障的完整性越好。通过使用专业的电阻测量仪，可以在不同的时间点和实验条件下对 TEER 进行动态监测，从而评估细胞屏障功能的变化。
• 渗透性实验 ：利用荧光标记的物质（如 FITC - dextran 等）进行渗透性实验，可以评估 cEND 细胞单层对不同分子量物质的通透性。通过检测荧光强度的变化，计算出物质的渗透系数，进而了解血脑屏障对物质的选择性通透性特点，这对于研究药物的脑内传递以及血脑屏障在疾病中的功能改变具有重要意义。

细胞在研究中的应用场景与技术要求

• 药物筛选与毒性研究 ：cEND 细胞可以用于药物透过血脑屏障的研究以及药物毒性评价。在药物筛选过程中，可以通过检测药物在细胞单层两侧的浓度变化、细胞的存活率、TEER 值的变化等指标，来评估药物的透过能力和对血脑屏障的潜在毒性。为了获得准确可靠的筛选结果，需要严格控制实验条件，确保细胞状态稳定，并采用合适的检测方法和数据分析手段。
• 细胞间相互作用研究 ：cEND 细胞还可以与神经元、星形胶质细胞等其他脑细胞类型进行共培养，以研究血脑屏障细胞与其他脑细胞之间的相互作用关系。在共培养体系中，可以通过观察细胞的形态变化、分泌因子的表达水平、细胞间的信号传导通路激活情况等，深入了解细胞间通讯在维持血脑屏障功能以及参与神经系统疾病发生发展过程中的作用机制。此外，还可以利用先进的成像技术（如共聚焦显微镜等）对细胞间的相互作用进行实时观察和分析，为研究提供更直观的证据。

细胞鉴定的技术手段与标准

免疫荧光染色鉴定

免疫荧光染色是常用的 cEND 细胞鉴定方法之一。通过使用针对特异性标记物（如 CD31、ZO - 1、occludin 等）的荧光标记抗体，可以对细胞进行染色，在荧光显微镜下观察细胞内标记物的表达和定位情况。正常的 cEND 细胞应该呈现特异性标记物的阳性表达，并且这些标记物在细胞间的紧密连接区域有明显的定位信号，这有助于确认细胞的身份和功能状态是否符合要求。

流式细胞术分析

流式细胞术可以快速、准确地测定 cEND 细胞表面标记物的表达水平。将细胞收集并进行适当的抗体标记后，通过流式细胞仪对细胞进行分析，可以获得细胞表面特定标记物的阳性率和平均荧光强度等数据。根据已知的 cEND 细胞标记物的表达特征，可以对细胞的纯度和特性进行定量评估，从而判断细胞是否符合实验研究的标准。

功能验证实验

除了上述的形态学和标记物表达鉴定方法外，还可以通过对 cEND 细胞进行功能验证实验来进一步确认其特性和适用性。例如，通过检测细胞单层对已知大小和性质的物质的通透性、测量 TEER 值的变化以及观察细胞在共培养体系中的行为等，来验证细胞是否具有正常的血脑屏障功能以及是否能够准确地模拟体内环境下的细胞行为。功能验证实验的结果可以作为评估细胞质量和技术参数是否符合要求的重要依据。