在细胞培养领域，永生化犬真皮成纤维细胞 - Ras 是一种极具价值的细胞模型，以下是其操作使用方面的详细介绍。

一、培养条件

（一）培养基成分

该细胞系推荐使用 PriGrow III 培养基，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 / 链霉素溶液。FBS 能为细胞生长提供必要营养物质、激素和生长因子，双抗溶液则可防止细菌和真菌污染。

（二）培养环境

细胞应在 37℃、5% CO?的恒温培养箱中培养。此环境有助于维持培养基的 pH 值稳定，同时为细胞提供适宜的生长温度和气体条件，使其 metabolic processes 运行更贴近体内生理环境，从而确保细胞正常生长和代谢。

二、传代操作

（一）传代比例

一般建议将细胞以 1:3 至 1:4 的比例进行传代培养。当细胞生长至覆盖培养瓶底面积的 80% - 90% 时，即可进行传代，避免细胞过度拥挤导致生长抑制和细胞状态下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液进行细胞消化。消化时，需密切观察细胞形态变化，一般在 37℃下消化 2 - 3 分钟，待细胞间隙增大、细胞边缘变圆并开始从培养瓶壁上脱落时，立即加入含血清的培养基终止消化。然后轻轻吹打细胞，使其完全脱落并形成均匀的细胞悬液，再进行分瓶培养。

三、冻存与复苏

（一）细胞冻存

冻存培养基由基础培养基、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）组成，比例为 90% FBS + 10% DMSO。将细胞收集并离心，弃去上清液后，用冻存培养基重悬细胞，调整细胞密度至 5×10? - 1×10? cells/mL 左右，分装于冻存管中，每管 1 mL。将冻存管置于程序降温盒中，放入 - 80℃冰箱中过夜，次日转移至液氮中长期保存。缓慢降温有助于细胞逐渐适应低温环境，减少细胞内冰晶的形成，从而提高细胞复苏后的存活率。

（二）细胞复苏

从液氮中取出冻存管，立即放入 37℃水浴中快速摇晃解冻，使细胞在 1 分钟左右完全解冻。用 70% 酒精消毒管外壁后，移入无菌超净工作台内。将冻存管中的细胞悬液全部转移到含有 9 mL 完全培养基的离心管中，用移液管轻轻吹打混匀，使 DMSO 浓度稀释至 10% 以下，以降低其对细胞的毒性。接着在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞接种于培养瓶中，放入 37℃、5% CO?培养箱中培养。

四、基因改造机制

该细胞系是通过将 Ras 基因导入犬真皮成纤维细胞而获得永生化。Ras 基因是一种原癌基因，可编码 GTP 酶。正常细胞中，Ras 蛋白处于活性状态时，能够结合 GTP 并激活下游的信号通路，如 MAPK 信号通路，参与细胞生长、分化、凋亡等生理过程的调控。当 Ras 基因异常表达或激活时，可破坏细胞正常的生长调控机制，使细胞获得无限增殖的能力，从而实现永生化。

五、细胞应用

（一）皮肤相关研究

永生化犬真皮成纤维细胞 - Ras 是研究皮肤生理和病理机制的重要细胞模型。成纤维细胞在皮肤的正常生理功能维持以及损伤后的修复过程中发挥关键作用，利用该细胞系，可深入探究影响皮肤的各种因素，为开发促进皮肤健康和修复的治疗方法提供理论基础。

（二）药物筛选

该细胞系可用于药物筛选，用于筛选能够调节细胞增殖、促进皮肤修复或改善皮肤相关疾病病理特征的药物。由于细胞具有永生化特性，可在较长时间内稳定地进行药物处理和实验观察，提高了药物筛选的效率和可靠性。