公司动态
 
首页 > 公司动态  >  永生化人类菌状味觉细胞——SV...

永生化人类菌状味觉细胞——SV40:细胞培养操作使用指南

2025-07-29

在细胞生物学研究领域,永生化人类菌状味觉细胞——SV40 是一种极具科研价值的细胞模型。通过 SV40 大 T 抗原的引入,这些细胞实现了永生化转变,为味觉生理学、病理学以及药物研发等研究方向提供了稳定且可持续的实验材料。下面将从细胞培养操作使用的角度,详细介绍这一细胞系的培养要点与应用技巧。

一、培养基的配制与选择依据

(一)基础成分及其功能

  1. 基础培养基类型

选择合适的培养基是细胞培养成功的关键。对于永生化人类菌状味觉细胞——SV40,常用的培养基包括 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)和 MEM(Minimum Essential Medium)。这些培养基含有葡萄糖、氨基酸、维生素等基本营养成分,为细胞提供能量和合成生物大分子所需的原料。DMEM/F12 培养基具有较高的缓冲能力和营养成分,适合细胞的长期培养;而 MEM 培养基则成分相对简单,适用于对培养条件要求较为基础的细胞。

  1. 血清添加与替代品

血清是培养基的重要补充成分,一般添加 10% 胎牛血清(FBS)。血清中含有丰富的生长因子、激素、附着因子等,促进细胞的增殖和贴壁。例如,成纤维细胞生长因子(FGF)能刺激细胞的 DNA 合成和细胞分裂,血清中的这些因子可维持细胞的正常生长状态。

但在某些研究中,为避免血清成分对实验结果的干扰,可采用无血清培养基。无血清培养基中通常添加了特定的生长因子和营养成分,以满足细胞生长的需求。在使用无血清培养基时,需根据细胞类型和实验需求进行优化调整,确保细胞在无血清环境下能够正常生长。

(二)培养基 pH 值与渗透压控制

  1. pH 值控制要点

细胞培养基的 pH 值应严格控制在 7.2 - 7.4 范围内。培养基中通常添加碳酸氢钠作为 pH 缓冲剂,在 5% CO?培养箱环境中形成碳酸缓冲体系。若 pH 值偏离正常范围,会影响细胞的酶活性和代谢过程。例如,过酸的环境可能导致细胞内溶酶体酶活性异常,引起细胞自溶。

  1. 渗透压维持方法

渗透压应维持在 280 - 320 mOsm/L,与正常生理环境相似。配制培养基时,精确称量各成分的用量,避免过高或过低的渗透压对细胞造成损伤。高渗透压会使细胞失水皱缩,低渗透压则导致细胞肿胀,均影响细胞正常功能。

二、细胞培养环境的标准化

(一)培养箱参数设置与监控

  1. 温度与气体环境

细胞培养应在 37℃、5% CO?、95% 空气湿度的培养箱中进行。温度的恒定对于维持细胞的正常生理活动至关重要,酶的活性、蛋白质合成等过程对温度极为敏感。CO?浓度的稳定是维持培养基 pH 值的关键。培养箱需配备精确的 CO?传感器和控制系统,定期校准。湿度的保持可防止培养基水分过度蒸发,导致培养基成分浓缩。可在培养箱内放置水盘,并定期补水。

  1. 培养箱清洁与维护

定期对培养箱进行清洁和消毒,防止细菌、真菌等微生物滋生。使用 75% 酒精擦拭培养箱内壁和各个角落,去除可能存在的污染物。同时,检查培养箱的门封是否完好,确保培养箱内的气体环境稳定。定期更换培养箱的过滤器,保证空气的流通和质量。

(二)无菌操作规范与防护措施

  1. 操作流程与注意事项

所有细胞培养操作应在生物安全柜内进行,生物安全柜应定期进行清洁和验证,确保其处于良好的工作状态。操作前,实验人员需用 75% 酒精对手部和实验台面进行消毒,并佩戴无菌手套、口罩和帽子。

细胞培养所用器械和耗材(如培养皿、移液管、吸头等)均需经过高压灭菌或伽马射线灭菌处理。在操作过程中,避免长时间暴露培养基和细胞于空气中,减少污染风险。例如,在进行细胞传代时,移液动作应迅速、准确,尽量缩短培养皿开启时间。

三、细胞传代与冻存技术要点

(一)细胞传代操作

  1. 传代时机判断

定期观察细胞的生长状态,判断是否需要进行传代操作。当细胞汇合度达到 70% - 80% 时,表明细胞处于良好的生长状态,此时进行传代可保证细胞的活力和增殖能力。若细胞过度生长,可能导致细胞老化、表型改变,影响实验结果。

  1. 传代步骤与注意事项

使用胰蛋白酶 - EDTA 消化液对细胞进行消化,将细胞从培养皿表面分离下来。消化时间应控制在 1 - 2 分钟,避免过度消化导致细胞损伤。将消化后的细胞悬液转移至离心管中,加入适量完全培养基终止消化,轻轻吹打混匀,以分散细胞团块。然后进行离心,收集细胞,用新鲜培养基重悬细胞,按适当比例分装到新的培养皿中,加入适量培养基,轻轻晃动培养皿,使细胞均匀分布。将培养皿放入培养箱中继续培养。

(二)细胞冻存技术

  1. 冻存液配方与选择

常用的冻存液配方为含 10% DMSO(二甲基亚砜)的完全培养基。DMSO 是一种常用的细胞冻存保护剂,它能够降低细胞内冰晶的形成,减少冰晶对细胞膜和细胞器的损伤。例如,在冻存永生化人类菌状味觉细胞——SV40 时,将细胞悬液与冻存液按 1:1 比例混合,使最终 DMSO 浓度为 5% - 10%。

  1. 冻存操作与保存

在细胞生长状态良好(汇合度 70% - 80%)、无污染的情况下进行冻存。先用胰蛋白酶消化细胞,制成单细胞悬液,用完全培养基洗涤 1 - 2 次,离心收集细胞,弃上清,加入冻存液轻轻吹打混匀,调整细胞浓度为 1 - 5×10? cells/ml。将细胞悬液分装入冻存管,每管 1 - 1.5ml,做好标记(包括细胞名称、冻存日期、代数等信息)。

采用程序降温法,将冻存管置于 - 80℃冰箱的程序降温盒中,设置降温速度为 - 1℃/min,使细胞缓慢冷却至 - 80℃。然后将冻存管转移到液氮罐的气相层中长期保存。若无程序降温盒,也可使用梯度降温法,先将冻存管在 4℃放置 30 分钟,再移入 - 20℃放置 1 小时,最后放入 - 80℃冰箱过夜,之后转入液氮罐。

四、细胞质量控制与鉴定方法

(一)细胞形态学观察

  1. 形态特征描述

永生化人类菌状味觉细胞——SV40 的典型形态为上皮样细胞,呈多边形或不规则形,细胞核较大,染色质分布均匀,有 1 - 2 个核仁。在倒置显微镜下,定期观察细胞形态变化,并拍照记录。若细胞出现形态异常,如多核、空泡化等,可能提示细胞受到污染或发生表型改变。

  1. 生长状态监测

细胞生长状态的观察包括细胞的贴壁情况、汇合度等。正常情况下,细胞在培养后 24 - 48 小时内贴壁生长,汇合度逐渐增加。若细胞长时间无法贴壁或出现大量悬浮细胞,需检查培养条件或细胞本身状态。

(二)免疫荧光染色鉴定

  1. 标志物选择与染色原理

利用免疫荧光染色法检测细胞表面或细胞内的特异性标志物。对于味觉细胞,常用标志物包括 α - 平滑肌肌动蛋白(α - SMA)、细胞角蛋白(Cytokeratin)等。例如,细胞角蛋白是上皮细胞的特异性标志物,在永生化人类菌状味觉细胞——SV40 中高度表达。通过荧光显微镜观察其表达和定位,可确认细胞类型。

  1. 染色步骤与注意事项

固定细胞:用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 - 20 分钟。

透化:用 0.1% - 0.5% Triton X - 100 处理细胞 5 - 10 分钟,使抗体能够进入细胞内部。

封闭:用 5% - 10% 小牛血清或山羊血清封闭非特异性结合位点,室温孵育 30 分钟 - 1 小时。

一抗孵育:加入稀释好的一抗,4℃孵育过夜。

洗涤:用 PBS 洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟,去除未结合的一抗。

二抗孵育:加入荧光标记的二抗,室温避光孵育 1 - 2 小时。

复染:用 DAPI 染细胞核,室温避光孵育 5 - 10 分钟。

洗涤:用 PBS 洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟,去除未结合的二抗和 DAPI。

观察与拍照:用荧光显微镜观察细胞,拍照记录染色结果。