细胞系概述与研究价值

Immortalized Human Intervertebral Disc Cartilage Endplate - Derived Stem Cells - SV40 是一种通过 SV40 大 T 抗原转化建立的永生化干细胞系，其在椎间盘退变研究、组织工程和再生医学等领域具有重要的研究价值。该细胞系保留了干细胞的自我更新能力和多向分化潜能，能够模拟椎间盘内干细胞的生物学行为，为相关疾病的机制研究和治疗方法开发提供了理想的体外模型。

细胞培养的关键操作步骤

培养条件的精确控制

该细胞系对培养条件要求较为严格，适宜的培养环境是保证细胞正常生长和维持其干性的重要因素。通常，细胞培养应在 37℃、5% CO?和 95% 相对湿度的细胞培养箱中进行。培养基一般选用含 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素 - 链霉素双抗的 DMEM/F12 培养基，并根据细胞生长状态定期更换培养基，一般每 2 - 3 天更换一次，以确保细胞能够获取充足的营养并维持适宜的生长环境。

细胞传代的规范操作

当细胞生长至培养瓶底面积的 80% - 90% 时，应及时进行传代操作。首先，用 PBS 轻柔地冲洗培养瓶，去除残留的培养基和细胞代谢产物。然后，加入适量的 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，待细胞逐渐变圆、脱落时，迅速加入含血清的培养基终止消化，将悬细胞液转移至离心管中进行离心（1000rpm，5min），弃去上清液，用新鲜培养基重悬细胞，按照 1:2 或 1:3 的比例进行传代接种至新的培养瓶中。在整个传代过程中，动作要轻柔，避免过度消化和剧烈摇晃，以防止细胞受到损伤。

细胞冻存与复苏的注意事项

细胞冻存时，应选择处于对数生长期、状态良好的细胞进行冻存操作。首先，配制含 10% 甘油、10% DMSO 和 80% 培养基的细胞冻存液，将细胞悬液与冻存液按适当比例混合，使细胞密度达到 1×10? - 5×10? cells/ml。然后，将混合后的细胞悬液分装至冻存管中，每管 1 - 1.5ml，做好标记。冻存过程需缓慢降温，可将冻存管置于 - 80℃冰箱的冻存盒中，以每分钟降低 1℃的速度逐渐降温，24 小时后转移至液氮罐中长期保存。

细胞复苏时，应快速将冻存管从液氮中取出，立即放入 37℃水浴中快速摇动，使细胞快速融化，整个过程控制在 1 分钟以内。然后，用 75% 酒精对冻存管外部进行消毒，将细胞悬液转移至离心管中进行离心（0100rpm，5min），弃去上清液，用新鲜培养基重悬细胞，将细胞接种至培养瓶中，放入 37℃、5% CO?培养箱中培养。在复苏后的 12 - 24 小时内，细胞可能会出现一定程度的应激反应，表现为细胞贴壁较慢、形态略显不规则等，这是正常现象。待细胞逐渐恢复生长状态后，可按照常规的培养和传代方法进行操作。

细胞鉴定与质量控制方法

细胞表型鉴定

对永生化人椎间盘软骨终板衍生干细胞 - SV40 进行表型鉴定是确保细胞系纯度和特性的重要环节。通过流式细胞术检测细胞表面标志物，如 CD90、CD105、CD44、CD45 等，优质的细胞系应高表达干细胞相关标志物（如 CD90、CD105 等），而低表达或不表达造血细胞标志物（如 CD45 等）。此外，还可以通过免疫荧光染色或 Western blotting 方法检测细胞内特定蛋白的表达，如 Sox9、Oct4 等干细胞相关转录因子，以进一步确认细胞的干性特征。

多向分化潜能评估

评估该细胞系的多向分化潜能是验证其干细胞特性的重要指标。在适当的诱导条件下，细胞应能够向成骨、软骨和脂肪等不同系细胞分化。成骨诱导实验中，细胞经诱导后可形成矿化结节，通过茜素红染色可见红色的矿化沉积；软骨诱导实验中，细胞可形成软骨样组织，经阿尔新蓝染色呈现蓝色；脂肪诱导实验中，细胞内出现脂滴，经油红 O 染色呈现红色。通过这些诱导实验，可以直观地展示细胞的多向分化能力，优质的细胞系分化效率应达到一定标准，如成骨诱导的矿化结节面积占比、软骨诱导的糖胺聚糖含量等指标均应符合要求。

细胞活力与增殖能力检测

细胞活力和增殖能力是衡量细胞系质量的关键指标。采用 CCK - 8 法或 MTT 法检测细胞的增殖活性，绘制细胞生长曲线，观察细胞在不同培养时间点的增殖速率。优质的细胞系应具有良好的增殖能力，在传代 5 - 10 代内细胞的活力保持稳定，OD 值（光密度值）呈持续上升趋势，且细胞的倍增时间相对较短，一般为 24 - 72 小时。同时，还应定期观察细胞的形态变化，正常的细胞应具有清晰的细胞边界、规则的细胞形态和良好的贴壁状态，这些都是细胞活力良好的表现。