FDH 在细胞甲醛代谢与癌症耐药研究中被高频引用，实验成败往往取决于操作细节而非试剂本身。下面把一份 96 孔板实验拆成 6 个关键节点，每个节点给出可落地的动作指令与常见故障排查，照着做能把板间 CV 压到 5% 以下。

样本制备：裂解液离子强度决定回收率

RIPA 高盐配方（150 mM NaCl）会抑制 FDH 活性 20–30%，改用 50 mM Tris-HCl + 0.1% Triton X-100 可把回收率拉回 95%。细胞刮下来后先 PBS 洗两遍，去掉培养基残留的甲醛，再按 10? cells/mL 加入裂解液，冰上 15 min 后 12 000 g 离心 10 min，取上清立即上机或液氮速冻。裂解液里加 1 mM DTT 可稳定酶活 48 h，但不要加 EDTA，它会螯合 FDH 所需的 Zn2?。

反应体系：乙醛替代甲醛为何更稳

试剂盒说明书常写“底物甲醛终浓度 5 mM”，实际操作中 37 °C 下甲醛挥发损失 10–15%，导致吸光度漂移。改用乙醛 2 mM 做替代底物，Km 值与甲醛接近，挥发可忽略，线性窗口从 10 min 延长到 30 min。NAD? 浓度固定在 1 mM，pH 9.0 的甘氨酸-NaOH 缓冲液能把 Vmax 推高 1.4 倍，适合低表达样本。

板布局：空白孔、标准孔、抑制孔如何排布

• 空白孔：裂解液 + 缓冲液 + NAD?，无乙醛，用来扣背景
• 标准孔：纯化 FDH 梯度 0–0.2 U/mL，做标曲
• 抑制孔：样本 + 5 mM 甲酸钠，验证信号特异性

每块板至少留出 4 个空白孔，分布在四角，避免边缘效应。标准孔做双列排布，一条用于实验当天，另一条封膜 4 °C 保存 24 h 内复测，验证板间稳定性。

读板参数：振荡延迟与双波长校正

酶标仪设 340 nm 检测 NADH 生成，动力学模式读 5 min，间隔 15 s。加乙醛启动反应后延迟 30 s 再开始读数，让液体表面张力稳定。开启 405 nm 参比波长，扣除气泡或纤维蛋白造成的散射。若使用 384 孔小体系，把振荡幅度降到 1 mm，防止液体飞溅。

故障排查：信号漂移与负值出现

信号漂移 90% 由挥发或温度不均导致。把板盖换成透气膜，37 °C 预热 5 min 再上机。出现负值通常是空白孔 OD 高于样本孔，检查空白孔是否误加乙醛，或裂解液里混入了细胞碎片。重新离心 5 min 可解决。

数据换算：蛋白归一与细胞归一并用

一张 96 孔板跑完，先用 BCA 测每孔总蛋白，把 U/mL 转成 U/mg。再用同一孔的细胞计数仪读数，得到 U/10? cells。两者比值可判断样本裂解效率：比值 <0.5 提示裂解不完全，需延长裂解时间或加大 Triton 浓度。