在细胞解毒机制研究和疾病标志物筛查领域，谷胱甘肽S-转移酶（GST）作为关键酶，其活性检测对于理解细胞抗氧化应激和药物代谢过程至关重要。本文聚焦于谷胱甘肽S-转移酶（GST）检测试剂盒的操作使用，提供详细且实用的实验指导。

样本准备与处理的关键步骤

在进行GST检测前，样本的准备与处理是确保实验结果准确可靠的第一步。对于组织样本，通常需要进行匀浆处理。取适量组织（约100-200mg），加入预冷的生理盐水或专用裂解缓冲液，使用组织研磨器或匀浆仪进行充分匀浆，确保组织细胞破裂释放出GST酶。匀浆过程中需在冰上操作，避免酶活性因温度升高而丧失。

细胞样本的处理则相对简便。收集对数生长期的细胞，通过离心（1000-2000rpm，5分钟）去除培养基，加入裂解液，按照适当比例（通常每百万细胞加入100-200μL裂解液）轻轻吹打混匀，使细胞充分裂解。裂解后的细胞悬液需在冰上孵育10-15分钟，期间可轻柔涡旋混匀数次，以确保酶充分释放。

无论组织还是细胞样本，裂解完成后均需进行离心（10000-14000rpm，10-15分钟，4℃），取上清液作为待测样本。此步骤可有效去除细胞碎片和其他不溶性杂质，防止其干扰后续的酶活性检测。

试剂准备与注意事项

在实验开始前，仔细阅读试剂盒说明书，了解各组分的储存条件和配制方法。通常，GST检测试剂盒包含GST底物（如CDNB）、NADPH再生系统（包含NADP?和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等）、以及其他缓冲液和辅助试剂。

底物溶液的配制需使用新鲜的超纯水，并根据实验所需量现配现用。例如，对于含有CDNB的底物溶液，需准确称取适量CDNB粉末，溶解于指定溶剂（通常是异丙醇或专用溶解液）中，配制成指定浓度（如10mM）。配制过程中应避免溶液接触皮肤和黏膜，因为CDNB具有一定毒性。

NADPH再生系统的组分需按照试剂盒说明书的顺序依次加入反应体系。例如，先加入NADP?，再加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和其他辅助因子。各组分加入后需充分混匀，但避免剧烈振荡产生气泡，因为气泡可能干扰后续的光谱检测读数。

检测过程中的关键操作细节

将待测样本、标准品和试剂按照试剂盒指定的顺序加入96孔板或比色皿中。以比色法检测为例，通常反应体系包含样本（20-50μL）、底物溶液（50-100μL）、NADPH再生系统（50-100μL），总体积根据具体试剂盒而定。

加入样本和试剂后，需立即启动反应计时。将反应体系放入酶标仪或分光光度计中，设置检测波长（通常为340nm，用于监测NADPH的吸光度变化）或根据试剂盒指定波长（如405nm用于监测CDNB与GSH结合产物的吸光度）。记录反应初始时刻（t=0）的吸光度值，并每隔30秒记录一次吸光度值，连续监测2-5分钟。

在数据记录过程中，需注意区分线性反应阶段和非线性阶段。线性反应阶段的吸光度变化率与GST酶活性呈正比关系，而非线性阶段（通常出现在反应后期）吸光度变化趋于平缓或出现波动，此时数据不宜用于计算酶活性。通过绘制吸光度值随时间变化曲线，选取线性部分计算斜率，进而根据标准曲线换算出样本中GST的活性单位。