在生物化学与细胞分析领域，非蛋白质巯基（Non-protein Sulfhydryl，NPSH）含量测定是评估细胞氧化还原状态、药物毒性以及疾病诊断的关键技术环节。其操作规范性与准确性对于科研成果的可靠性以及临床诊断的精准性具有决定性意义。

非蛋白质巯基基本概念与生物学意义

非蛋白质巯基主要指细胞内除蛋白质巯基之外的游离巯基，包括谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）等小分子巯基化合物。这些物质在维持细胞内氧化还原平衡、抵御氧化应激损伤、参与细胞信号转导以及解毒过程中发挥着至关重要的作用。例如，在肝脏细胞中，GSH 占非蛋白质巯基总量的 85% - 90%，它通过与自由基反应，清除活性氧（ROS）与活性氮（RNS），保护细胞免受氧化损伤；在胰岛 β 细胞中，Cys 作为胰岛素合成过程中的重要巯基供体，其浓度变化直接影响胰岛素二硫键正确形成与分泌，非蛋白质巯基浓度异常降低常与 2 型糖尿病胰岛素抵抗及 β 细胞功能障碍密切相关。

非蛋白质巯基测定工作原理与方法选择

巯基特异性显色反应原理

非蛋白质巯基测定基于巯基与特定试剂发生氧化还原或络合反应产生可定量检测的显色或荧光产物。常用试剂 5,5' - 二硫代双 (2 - 硝基苯甲酸)（DTNB）与巯基定量反应生成 5 - 硝基 - 2 - 硫代苯甲酸（TNB - ），TNB - 在 412nm 处具有特征吸收峰，其吸光度值与样本中非蛋白质巯基浓度呈正比关系。反应方程式为：DTNB + SH → TNB - + S - S，摩尔消光系数为 13600 L·mol?1·cm?1，检测灵敏度可达 0.1 - 1μmol/L。此方法操作简便、成本较低，适用于常规实验室批量样本检测，但易受样本中其他还原性物质（如维生素 C、尿酸等）干扰，需通过预处理去除干扰物质。

荧光标记与检测原理

新型荧光探针（如 Monobromobimane，MB）与巯基反应生成强荧光产物（荧光激发波长 380 - 400nm，发射波长 460 - 490nm），荧光强度与非蛋白质巯基浓度在 0 - 10μmol/L 范围内呈良好线性关系（线性相关系数 R2 ≥ 0.99）。荧光检测方法具有高灵敏度、高特异性优点，可检测低至纳摩尔级别非蛋白质巯基浓度，特别适用于微量样本（如单细胞、组织切片）分析，但仪器成本较高、操作相对复杂，对实验环境要求严格（需避光操作，防止荧光淬灭）。

非蛋白质巯基测定操作步骤与要点

样本采集与前处理

对于细胞样本，收集对数生长期细胞，用预冷 PBS 洗涤 2 - 3 次，离心去除培养基与PBS，加入裂解液（含蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解与去磷酸化干扰测定）按 106 个细胞 / mL 比例裂解，冰上孵育 15 - 30 分钟，4℃ 12000rpm 离心 10 分钟取上清，即为非蛋白质巯基提取液。动物组织样本需精确称取 0.1 - 0.2g 组织，用组织研磨器在液氮环境下研磨成细粉，加入 1mL 裂解液，冰浴超声破碎（功率 200W，超声 3 秒，间隔 5 秒，重复 10 次），4℃ 12000rpm 离心 15 分钟取上清。血浆样本直接离心（3000rpm，10 分钟，4℃）取上清，所有样本提取液分装于EP管，-80℃保存，避免反复冻融。

测定步骤与条件控制

以 DTNB 法为例，取 100μL 样本提取液于 96 孔板，加入 100μL 0.3mmol/L DTNB 溶液（用 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 配制，现用现配），混匀后室温避光反应 10 分钟，用酶标仪在 412nm 波长测定吸光度值。每个样本设置 3 个复孔，同时设置试剂空白对照（以样本提取液替换 DTNB 溶液）。荧光法操作中，取 50μL 样本提取液于 384 孔黑板，加入 50μL 50μmol/L MB 溶液（用 DMSO 配制，终浓度 25μmol/L），37℃避光反应 30 分钟，用荧光酶标仪在 Ex/Em=380/460nm 测定荧光强度。两种方法均需提前制作标准曲线，用 GSH 标准品（浓度范围 0 - 50μmol/L）按相同步骤测定，绘制吸光度值或荧光强度与浓度的标准曲线，计算样本非蛋白质巯基浓度。

非蛋白质巯基测定质量控制与结果分析

质量控制措施

每日检测前需测定质控样本（低、中、高三个浓度水平），其测定值应落入靶值 ±15% 范围内。质控样本可采用商业化的非蛋白质巯基定值血清或自制质控样本（将已知浓度 GSH 溶液与正常血浆或细胞提取液混合制备）。每 20 个样本检测插入一个重复质控样本，监控检测过程稳定性。定期参加外部质量评价计划（如英国皇家生物学会 RSB 非蛋白质巯基检测室间质评），确保实验室检测结果与国际标准一致。

结果分析与临床意义解读

非蛋白质巯基浓度在不同组织与细胞类型差异显著，如肝脏细胞非蛋白质巯基含量高达 5 - 10mmol/kg 蛋白质，而红细胞内浓度约为 1 - 2mmol/g 血红蛋白。在氧化应激相关疾病（如肝病、肾病、心血管疾病、神经退行性疾病）中，非蛋白质巯基浓度普遍降低 30% - 70%，其下降程度与疾病严重程度呈正相关。例如，在急性肝炎患者血清中，非蛋白质巯基浓度可从正常值 0.8 - 1.2mmol/L 降至 0.3 - 0.5mmol/L，同时转氨酶显著升高；在 2 型糖尿病患者胰岛细胞中，非蛋白质巯基减少导致胰岛素合成障碍，空腹血糖与糖化血红蛋白水平升高。动态监测非蛋白质巯基浓度变化可评估疾病进展与治疗效果，如肝硬化患者经保肝治疗后，非蛋白质巯基浓度逐渐回升，与肝功能指标（白蛋白、凝血酶原时间）改善同步发生。

非蛋白质巯基测定技术优化与常见问题解决

提高检测灵敏度与特异性的方法

为降低样本中维生素 C、尿酸等还原性物质干扰，可在样本提取液中加入适量 N - 乙基顺乌头酸盐（NEAA，终浓度 1mmol/L），此试剂可特异性抑制维生素 C 氧化还原酶活性，消除维生素 C 干扰。对于复杂生物样本（如血浆、组织匀浆），采用固相萃取（SPE）技术预处理，用亲水性 C18 柱吸附非蛋白质巯基，洗脱后测定，可提高检测灵敏度 2 - 5 倍。优化反应条件，如将 DTNB 法反应温度提高至 37℃，反应时间延长至 15 分钟，可使检测下限降至 0.05μmol/L；荧光法中，将反应 pH 调整至 7.8 - 8.0，MB 浓度优化为 30μmol/L，可增强荧光信号强度 30% - 40%。

仪器校准与维护要点

酶标仪需每月使用标准滤光片校准波长准确性（误差＜±1nm），每季度检查光路系统，确保光强稳定性（波动＜±2%）。荧光酶标仪除波长校准外，还需定期校准荧光强度（使用荧光标准品，如荧光素钠溶液），校准频率为每月一次。仪器使用完毕后，立即用蒸馏水冲洗比色皿或微孔板，防止残留试剂结晶损坏仪器。对于长期不用的仪器，每月至少开机运行 30 分钟，进行自检与预热，延长仪器使用寿命。