试剂盒组成及作用

TUNEL 法细胞凋亡 / 周期检测试剂盒主要包含 TUNEL 反应混合液、TdT 酶、荧光标记物（如 FITC）、核染色液（如 DAPI）和洗涤缓冲液。TUNEL 反应混合液中含有脱氧核糖核苷酸底物和必要的反应缓冲液，为 TdT 酶的催化反应提供底物和适宜环境，TdT 酶能将脱氧核糖核苷酸底物连接到 DNA 断裂处的 3'-OH 末端，荧光标记物用于标记新连接的脱氧核糖核苷酸，使凋亡细胞发出荧光，核染色液用于染色细胞核，便于观察细胞核形态变化，洗涤缓冲液用于去除未结合的反应物和杂质，减少背景干扰。

工作原理

DNA 断裂与 3'-OH 末端形成

细胞凋亡时，核酸内切酶被激活，选择性地切割核小体之间的连接区 DNA，产生具有 3'-OH 末端的 DNA 片段。这些 DNA 片段是 TUNEL 法检测细胞凋亡的关键标志物，其数量和分布与细胞凋亡程度密切相关。

TdT 酶标记原理

TdT 酶是一种不需要引物和模板的 DNA 聚合酶，能将脱氧核糖核苷酸底物连接到 DNA 片段的 3'-OH 末端。在 TUNEL 法中，TdT 酶将带有荧光标记的脱氧核糖核苷酸底物连接到凋亡细胞 DNA 断裂处的 3'-OH 末端，使凋亡细胞的 DNA 被荧光标记，从而实现对凋亡细胞的特异性标记。

荧光标记与检测

荧光标记后的 DNA 片段在荧光显微镜或流式细胞仪下发出特定波长的荧光，可通过检测荧光强度和分布来分析细胞凋亡情况。FITC 标记的 DNA 片段在激发光波长为 488 - 500nm 时发出绿色荧光，可与细胞核染色液 DAPI 染色的细胞核（发出蓝色荧光）进行双重染色，通过荧光显微镜观察细胞核形态变化和荧光标记情况，区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。

检测步骤及关键要点

细胞固定与通透

在进行 TUNEL 反应前，需对细胞进行固定和通透处理。对于贴壁细胞，用 4% 多聚甲醛固定 15 - 30 分钟，使细胞结构固定，防止细胞在后续操作中脱落或变形。然后用 0.1% - 0.2% Triton X-100 处理 5 - 10 分钟，使细胞膜通透，便于 TdT 酶和底物进入细胞内与 DNA 断裂处结合。对于悬浮细胞，可先离心收集细胞，再进行固定和通透处理。

TUNEL 反应与标记

将固定和通透后的细胞与 TUNEL 反应混合液在 37℃、湿润环境下孵育 1 - 2 小时。孵育过程中，TdT 酶将荧光标记的脱氧核糖核苷酸底物连接到 DNA 断裂处的 3'-OH 末端，标记凋亡细胞。孵育时间需根据细胞类型和实验需求优化，以获得最佳标记效果。孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤细胞，去除未结合的反应物，减少背景荧光。

荧光显微镜观察与分析

在荧光显微镜下观察细胞，设置合适的激发和发射滤光片，如 FITC 的激发波长为 488 - 500nm，发射波长为 520nm 左右。通过观察细胞核形态和荧光标记情况，可区分不同状态的细胞：活细胞的细胞核完整，无荧光标记；凋亡细胞的细胞核出现浓缩、碎裂，并发出绿色荧光；坏死细胞的细胞核结构破坏严重，荧光标记较弱或不均匀。

流式细胞仪检测与定量分析

对于高通量、定量分析，将标记后的细胞用流式细胞仪检测。设置合适的荧光通道，如 FITC 荧光在 FL1 通道检测。根据荧光强度和细胞核染色情况，区分凋亡细胞和非凋亡细胞，并计算凋亡细胞比例。流式细胞仪检测可快速分析大量细胞，提供更准确的定量数据。