细胞凋亡是维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序死亡过程。在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜内侧，细胞凋亡早期，PS 会从细胞膜内侧翻转到外侧，暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为 35-36kDa 的钙离子依赖型磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。Annexin V-AbFluor? 405 细胞凋亡检测试剂盒中的 Annexin V 被 AbFluor? 405 荧光染料标记，可通过流式细胞仪或荧光显微镜检测早期凋亡细胞。

碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，不能透过完整细胞膜。早期凋亡细胞的细胞膜保持完整，对 PI 有拒染性；但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能透过细胞膜，使细胞核染上红色荧光。将 Annexin V 与 PI 匹配使用，可区分活细胞、早期凋亡细胞以及凋亡中晚期或坏死细胞。

具体来说，使用 Annexin V-AbFluor? 405 和 PI 染色细胞群后，在流式细胞仪或荧光显微镜下观察：活细胞因细胞膜完整，Annexin V-AbFluor? 405 无法与其结合，几乎无荧光；早期凋亡细胞的 PS 外翻，Annexin V-AbFluor? 405 与其结合，使细胞膜呈现蓝色荧光；凋亡中晚期或坏死细胞，细胞膜破损，PI 进入细胞与核酸结合，使细胞核呈现红色荧光，同时细胞膜上结合的 Annexin V-AbFluor? 405 使其呈现蓝色荧光。

操作步骤

• 流式细胞仪分析 ：
  1. 通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。
  2. 4℃，300g 离心 5min 收集 1-2×10^5 细胞，用冰预冷的 PBS 洗涤两次。贴壁细胞使用胰酶消化后离心收集细胞，需控制胰酶消化时间，避免细胞膜结构损伤出现细胞坏死假阳性。
  3. 用 100μL 1×Annexin V Binding Buffer 重悬细胞。
  4. 每 100μL 细胞悬液中加入 4-5μL Annexin V-AbFlour? 405 和 1-2μL PI，轻柔混匀。
  5. 室温避光孵育 15min。
  6. 孵育结束后加入 400μL 1×Annexin V Binding Buffer，轻柔混匀后置于冰上。染色后 30min 内通过流式细胞仪分析细胞，使用 404nm 和 535nm 激发，431nm 和 617nm 附近测量荧光。
• 荧光显微镜分析 ：
  • 悬浮细胞 ：按流式细胞分析步骤操作后，将细胞悬浮置于玻片上，用盖玻片盖住细胞，尽快使用适当滤镜通过荧光显微镜分析细胞。
  • 贴壁细胞 ：
    1. 细胞接种于爬片或腔室载玻片上，培养细胞。
    2. 通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。
    3. 除去培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。
    4. 准备工作液：每 100μL 1×Annexin V Binding Buffer 添加 4-5μL Annexin V-AbFlour? 405 和 1-2μL PI，轻柔混匀。最佳浓度可根据具体实验要求确定。
    5. 在细胞中加入适量工作液，确保工作液完全覆盖细胞，室温避光孵育 15-30min，也可在冰上孵育，但孵育时间需延长到至少 30min。
    6. 用 1×Annexin V Binding Buffer 洗涤细胞两次，此步不要使用 PBS 洗涤细胞。
    7. 载玻片上添加一滴 1×Annexin V Binding Buffer，然后将细胞爬片置于载玻片上，对于细胞腔室载玻片上的细胞，添加足够 1×Annexin V Binding Buffer 覆盖细胞，也可使用抗荧光淬灭封片剂封片。
    8. 使用适当滤光片在荧光显微镜下分析细胞。

试剂盒组分及储存

试剂盒包含 Annexin V Binding Buffer（5×）、Annexin V-AbFluor? 405、Propidium Iodide（PI）。Annexin V Binding Buffer（5×）需按说明用去离子水稀释成 1×Annexin V Binding Buffer。Annexin V-AbFluor? 405 和 PI 均为即用型，使用前需平衡到室温。试剂盒在 4℃避光保存，稳定期至少 6 个月。

技术参数

Annexin V-AbFluor? 405 的激发波长 / 发射波长为 404nm/431nm，PI 与 DNA 结合后的激发波长 / 发射波长为 535nm/617nm。