一、试剂盒概述

CheKine? 辅酶ⅠNAD(H）含量检测试剂盒（微量法）是一种用于检测样本中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）及其还原形式 NADH 含量的工具。NAD 在细胞内氧化还原反应中发挥关键作用，作为电子载体在 NAD 和 NADH 形式之间循环转化。此外，NAD 还参与 ADP - 核糖基化反应以及作为 sirtuins 的底物，在细胞信号传导、基因表达调控和能量代谢中具有重要地位。该试剂盒采用微量法，具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点，适用于多种生物样本的检测。

二、检测原理

该试剂盒基于酶循环反应和化学发光信号放大。NADH 在特定酶的作用下被氧化为 NAD?，同时产生还原型辅酶Ⅰ的循环反应。通过化学发光底物与反应体系中的信号放大系统相互作用，产生与 NAD(H）含量成正比的光信号。利用化学发光信号的强度定量分析样本中 NAD(H）的含量。

三、实验步骤

（一）样本准备

1. 细胞样本 ：收集细胞，用预冷的生理盐水洗涤，加入细胞裂解液，吹打混匀，冰上裂解，离心取上清液。
2. 组织样本 ：称取适量组织，用预冷的生理盐水洗涤，按质量体积比加入组织裂解液，冰上充分匀浆，离心取上清液。
3. 血浆 / 血清样本 ：采集血液样本，静置凝固后离心取上清液（血清）；或采集血液后立即加入抗凝剂，混匀后离心取上清液（血浆）。

（二）试剂准备

1. 试剂配制 ：按照试剂盒说明书的要求，配制相应的试剂，如工作液、酶溶液、底物溶液等。
2. 试剂预冷 ：将配制好的试剂置于冰上预冷，以减少反应过程中的非特异性误差。

（三）反应体系设置

1. 反应体系组成 ：在微量反应板或适当容器中，依次加入样本、试剂盒提供的酶溶液、工作液和底物溶液，轻轻混匀。
2. 反应条件 ：将反应体系置于合适温度（一般为 37℃）下孵育一定时间，使反应充分进行。

（四）检测

1. 化学发光检测 ：使用化学发光检测仪检测反应体系产生的光信号。检测前应确保仪器已预热并校准，以保证检测结果的准确性。
2. 标准曲线绘制 ：使用试剂盒提供的标准品，按照说明书的要求进行稀释和检测，绘制标准曲线。

四、实验结果解读

1. 含量计算 ：根据测得的样本化学发光信号强度和标准曲线，计算样本中 NAD(H）的含量。
2. 结果分析 ：NAD(H）含量的变化可反映细胞的氧化还原状态和代谢活动。例如，在氧化应激状态下，NADH 含量可能减少；而在某些代谢疾病中，NAD(H）含量可能出现异常。
3. 注意事项 ：实验过程中需严格控制反应条件，避免样本之间的交叉污染。同时，应设置适当的对照组，以确保实验结果的准确性和可靠性。

五、应用领域

CheKine? 辅酶ⅠNAD(H）含量检测试剂盒（微量法）具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点，适用于以下领域：

1. 代谢研究 ：用于研究细胞的氧化还原状态和能量代谢过程，特别是在氧化应激和抗氧化防御机制中的作用。
2. 疾病诊断 ：辅助诊断与代谢异常相关的疾病，如糖尿病、某些神经退行性疾病等。
3. 药物筛选 ：评估药物对 NAD(H）含量的影响，筛选潜在的代谢调节药物。
4. 表观遗传学研究 ：研究 sirtuins 等依赖 NAD 的酶在基因表达调控中的作用。