彗星法 DNA 损伤分析试剂盒（3 孔载玻片）是一种单细胞凝胶电泳试验（SCGE），用于快速、灵敏地检测细胞 DNA 损伤。当细胞受到辐射、重金属等处理后，DNA 可能发生单链或双链断裂。将细胞与融化的琼脂糖混合后置于 3 孔载玻片上，用裂解液破坏细胞膜，再用碱性溶液使 DNA 解旋。在电场作用下，正常细胞的大分子 DNA 迁移距离较短，完整 DNA 仍保留在细胞核的范围；而 DNA 断裂碎片则迁移出细胞核。通过 PI 染料染色后，在荧光显微镜下观察，完整 DNA 形成圆形或轻微拖尾的图谱，DNA 断裂碎片则形成彗星状的电泳图谱。这种检测方法能够直观地反映出细胞 DNA 的损伤情况，为研究 DNA 损伤机制和相关保护措施提供重要依据。

操作步骤详解

样品准备

• 细胞收集 ：根据实验目的选择合适的细胞类型，如血液细胞、组织细胞等。对于贴壁细胞，可采用胰酶消化法收集；对于悬浮细胞，直接离心收集。收集后的细胞用预冷的生理盐水洗涤 2 - 3 次，去除残留的培养基和血清成分。
• 细胞浓度调整 ：将收集好的细胞制成单细胞悬液，用细胞计数板计数后，调整细胞浓度至适宜范围，一般为 1×10^5^ - 1×10^6^ 个 / mL。细胞浓度过高可能导致细胞重叠，影响电泳结果；浓度过低则会使检测信号较弱，降低检测灵敏度。

加样与制片

• 琼脂糖混合 ：将适量的低熔点琼脂糖溶液加热至完全融化，待温度降至约 37℃时，与细胞悬液按一定比例混合，轻轻吹打混匀。注意避免产生气泡，以免影响后续制片效果。
• 加样制片 ：将混合好的细胞 - 琼脂糖溶液迅速铺在 3 孔载玻片的每个孔中，确保每个孔的溶液量均匀。将载玻片水平放置，待琼脂糖溶液凝固后，用镊子轻轻夹起载玻片边缘，检查琼脂糖层是否均匀平整。若发现有气泡或琼脂糖层不均匀的情况，需重新制片。

裂解与解旋

• 裂解处理 ：将制好的载玻片放入裂解液中，裂解液的主要成分包括去污剂、盐等，可破坏细胞膜和细胞核膜，释放出细胞内容物。裂解过程通常在 4℃下进行，时间约为 30 - 60 分钟。裂解过程中需注意避免样品污染，同时确保裂解完全，使 DNA 充分暴露。
• 碱性解旋 ：裂解后的载玻片置于碱性溶液中，如含有氢氧化钠的溶液，使 DNA 解旋。解旋时间一般为 20 - 30 分钟，温度控制在 4℃左右。碱性解旋的目的是使 DNA 双链分离，便于后续电泳过程中 DNA 片段的迁移。

电泳与染色

• 电泳条件设置 ：将载玻片放入水平电泳槽中，确保电极方向正确，使 DNA 片段能够向正极方向迁移。电泳缓冲液一般为碱性溶液，如氢氧化钠和硼酸的混合溶液。电泳电压设置为 20 - 30 V，电流约为 300 - 400 mA，电泳时间根据细胞类型和 DNA 损伤程度而定，通常为 20 - 40 分钟。电泳过程中需密切观察 DNA 迁移情况，避免过度电泳导致 DNA 片段扩散过大，影响结果分析。
• 染色与观察 ：电泳结束后，用中和缓冲液中和多余的碱性溶液，然后将载玻片浸泡在含有 PI 染料的染色液中，避光染色 10 - 20 分钟。PI 染料能够与 DNA 结合，在荧光显微镜下发出红色荧光。染色完成后，用荧光显微镜观察细胞 DNA 的迁移情况，并拍摄图像。通过分析细胞的彗星图谱，包括彗星头部（完整 DNA）和尾部（断裂 DNA 片段）的长度、荧光强度等参数，可定量评估细胞 DNA 损伤程度。

实验结果解读与分析

• 定性分析 ：在荧光显微镜下，正常细胞的 DNA 呈现为圆形或轻微拖尾的图谱，表明 DNA 完整性较好；而 DNA 损伤的细胞则呈现出明显的彗星状电泳图谱，尾部长度越长，说明 DNA 断裂程度越严重。通过观察多个细胞的彗星图谱，可以初步判断细胞群体的 DNA 损伤情况。
• 定量分析 ：使用图像分析软件对彗星图谱进行定量分析，可测量彗星头部和尾部的荧光强度、尾长等参数。根据这些参数计算 DNA 损伤指标，如尾部 DNA 含量百分比、尾长、橄榄尾矩等。尾部 DNA 含量百分比越高、尾长越长、橄榄尾矩越大，表明细胞 DNA 损伤程度越严重。通过对这些指标的统计分析，可定量评估不同处理条件下细胞 DNA 损伤的差异。
• 结果影响因素考虑 ：实验结果可能受到多种因素的影响，如细胞类型、处理方式、染色时间、电泳条件等。在分析结果时，需综合考虑这些因素，排除假阳性或假阴性结果的可能性。例如，不同细胞类型的 DNA 含量和结构可能存在差异，对电泳迁移和染色效果产生影响；染色时间过长可能导致背景信号过高，影响结果判断；电泳电压和时间的不当设置也会导致 DNA 片段迁移异常，使结果不准确。因此，在实验过程中需严格控制实验条件，确保结果的可靠性和重复性。