原理
肝脂酶（hepaticlipase，HL）是一种脂肪分解酶，在肝实质细胞中合成，存在于肝脏窦周间隙内皮细胞表面和窦周间隙腔面的肝细胞微绒毛表面，可水解各种脂蛋白中的甘油三酯（TG）和磷脂（PL），使各种脂蛋白颗粒的大小和密度发生变化，当血浆中的HL及其活性增高时，可导致血浆中低密度脂蛋白（LDL）水平升高，加速动脉粥样硬化的发生与发展。HL水解α-乙酸萘酯产生α-萘酚，可与固蓝B盐形成紫红色偶氮化合物，在595 nm有特征吸收峰，其颜色深浅在一定范围内与HL活性成正相关。
自备耗材
·酶标仪或可见分光光度计（能测595 nm处的吸光度）
·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
·恒温水浴锅、制冰机、离心机
·去离子水、丙酮
·研钵或匀浆器
试剂准备
Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温，若有沉淀析出属正常现象，室温静置至沉淀消失即可（期间请勿大力摇晃）。4℃保存。
Reagent IV：临用前配制；48 T加入0.7 mL去离子水，96 T加入1.4 mL去离子水，吹打至充分溶解，用不完的试剂-20℃分装避光可以保存2周，避免反复冻融。
Standard：临用前配制；加入1 mL丙酮配制成10 μmol/mL的α-萘酚标准溶液，用不完的试剂-20℃避光可以保存2周。
注意：Reagent II有毒，Standard有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。
标准品制备：吸取30 μL 10 μmol/mL的α-萘酚标准溶液于EP管中，向其中加入930 μL Reagent I配制成0.3125 μmol/mL的α-萘酚标准品，现用现配。
样本制备
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。
1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Reagent I，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
2.血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。
注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min，调节波长到595 nm。可见分光光度计用去离子水调零。
2.将Reagent III在30℃预热20 min以上。
3.操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：
|
试剂
|
测定孔（μL）
|
对照孔（μL）
|
标准孔（μL）
|
空白孔（μL）
|
|
样本上清
|
20
|
20
|
0
|
0
|
|
标准品
|
0
|
0
|
20
|
0
|
|
Reagent I
|
80
|
90
|
80
|
100
|
|
Reagent II
|
10
|
0
|
10
|
10
|
|
混匀，30℃反应10 min
|
无需反应，直接加入以下试剂
|
|
Reagent III
|
80
|
80
|
80
|
80
|
|
Reagent IV
|
10
|
10
|
10
|
10
|
充分混匀，30℃静置5 min后，于595 nm处测定吸光值，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白，计算ΔA测定=A测定-A对照、ΔA标准=A标准-A空白。
注意：每个测定管孔设一个对照孔，标准曲线和空白孔只用测1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.05可适当加大样本量。如果ΔA测定大于0.7，样本可用去Reagent I进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
HL活力的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
酶活单位定义：每mg蛋白每分钟水解α-乙酸萘酯产生1 μmol的α-萘酚为一个酶活力单位。
HL (U/mg prot)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(Cpr×V样)÷T×F=0.03125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr×F
（2）按样本鲜重计算：
酶活单位定义：每g组织每分钟水解α-乙酸萘酯产生1 μmol的α-萘酚为一个酶活力单位。
HL (U/g 鲜重)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(W×V样÷V样总)÷T×F=0.03125×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F
（3）按样本体积计算：
酶活单位定义：每mL血清每分钟水解α-乙酸萘酯产生1 μmol的α-萘酚为一个酶活力单位。
HL (U/mL)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷V样÷T×F=0.03125×ΔA测定÷ΔA标准×F
C标准：α-萘酚标准品浓度，0.3125 μmol/mL；V样：反应体系中加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入Reagent I总体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，10 min；W：样品质量，g；F：样本稀释倍数。
注意事项
1.Reagent III出现气泡可静置，待气泡消失，加样时不要吸到气泡。
2.Reagent IV可能会析出少量沉淀，吹打使其充分溶解。
3.若样本为动物肝脏，建议将样本用Reagent I稀释25倍以上再进行检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。
若样本为肥胖型动物血清或血浆，建议将样本用Reagent I稀释5倍以上再进行检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。
公司动态