过氧化氢酶（CAT）Pro活性检测试剂盒实验解决方案-亚科因（武汉）生物技术有限公司

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过氧化氢酶（CAT）Pro活性检测试剂盒实验解决方案

2025-02-07

CheKine? Pro 过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒（荧光法）可检测动物或植物组织、细胞、血清（浆）或其他液体等样本，其原理是在检测体系中过氧化氢酶（CAT）分解H2O2产生水和氧气，未分解的过氧化氢在酶和荧光物质存在下反应，其在激发波长535 nm和发射波长587 nm处的荧光强度与过氧化氢浓度成正比。

自备耗材

·荧光酶标仪（激发波长为535 nm，发射波长为587 nm）

·全黑96孔板、可调节式移液枪及枪头

·低温离心机、恒温箱、制冰机

·去离子水，PBS (pH 7.0)

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；用不完的试剂在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

ReagentⅡ：即用型；-20℃避光保存。

H2O2 ReagentⅢ：临用前配制；取5 μL ReagentⅢ加入4.995 mL去离子水，混匀，取15 μL稀释后的ReagentⅢ，加入4.395 mL Assay Buffer，混匀，现用现配，按需配制，当天内使用。

Working Reagent：临用前避光配制；取50 μL ReagentⅠ和20 μL ReagentⅡ，加入4.93 mL Assay Buffer，充分混匀，该体积可用100次，按需配制，当天内使用，使用时须避光。

Standard (1 M)：使用前，用去离子水稀释10,000倍得到0.1 mM标准品，充分溶解待用。用不完的Standard (1 M) -20℃避光分装保存，避免反复冻融。

注意：ReagentⅠ有毒，ReagentⅢ有腐蚀性，建议在通风橱进行实验。

Standard设置：按下表所示，配制标准品溶液。

序号	0.1 mM标准品体积（μL）	去离子水体积（μL）	标准品浓度（μM）
Std.1	100	100	50
Std.2	80	120	40
Std.3	40	160	20
Std.4	20	180	10
Std.5	10	190	5
Std.6	5	195	2.5
Std.7	2.5	197.5	1.25
0（空白孔）	0	200	0

注意：稀释的标准品溶液现配现用，尽快检测，不宜长久放置。

样本制备

注意：样本以新鲜为宜，若不能立刻检测，应储存在-80℃保存。

1. 动植物组织：称取0.1 g样本，加入1 mL冷的Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

2. 细胞：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL冷的Assay Buffer，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

3. 血清或其他液体样本：10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：1. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本用Assay Buffer稀释成不同浓度进行预实验，根据预试验的结果，结合本试剂盒的线性范围：0.01-10 U/mL，请参考下表稀释（仅供参考）。

样本	稀释倍数	样本	稀释倍数
10%小鼠脑	30-60	10%小鼠肺	150-300
胎牛血清	2-10	293 cells	4-10
人唾液	30-60	L929细胞上清	不稀释
人尿液	30-50	10%烟草叶	2-6

2.如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 荧光酶标仪预热到37℃，调节激发波长为535 nm，发射波长为587 nm。

2. 操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）：

试剂		测定孔（μL）		对照孔（μL）		标准孔（μL）
样本	25		0		0
Standard	0		0		25
去离子水	0		0		25
H₂O₂ ReagentⅢ	25		25		0
酶标仪上振板10 s，37℃反应5 min
Working Reagent	50		50		50
样本	0		25		0
混匀，室温避光静置10 min，荧光酶标仪上设置激发波长535 nm，发射波长587 nm，测定各孔荧光值，分别记为RFU_测定、RFU_对照、RFU_标准和RFU_空白，计算ΔRFU_测定=RFU_对照-RFU_测定，ΔRFU_标准=RFU_标准-RFU_空白。

结果计算

1.标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为x轴，ΔRFU标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔRFU测定带入方程得到x (μM)。

2.CAT活性的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：37℃条件下，每mg蛋白每分钟分解1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。

CAT(U/mg prot)=x×f÷5÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：37℃条件下，每g组织每分钟分解1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。

CAT(U/g 鲜重)=x×f÷5÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：37℃条件下，每104个细胞每分钟分解1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。

CAT(U/104 cell)=x×f÷5÷N

（4）按液体体积计算：

酶活单位定义：37℃条件下，每mL液体每分钟分解1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。

CAT(U/mL)=x×f÷5

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；5：反应时间，5 min；f：样本稀释倍数；W：样品质量，g；N：细胞总数，万。

结果展示

典型标准曲线：

Figure 1. CAT的标准曲线

示例：

1.取0.16 g小鼠脑加入1 mL Assay Buffer进行匀浆研磨，离心取上清稀释50倍之后按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得：

RFU测定为10,395，RFU对照为16,600，RFU空白为305，ΔRFU测定=16,600-10,395=6,205，标准曲线为y=568.3x+501.83，H2O2浓度为10.04 μM，CAT（样本）=10.04×50÷5÷0.16=627.5 U/g 鲜重。

2.取胎牛血清离心取上清稀释5倍之后按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得：

RFU测定为6,380，RFU对照为13,390，RFU空白为305，ΔRFU测定=13,390-6,380=7010，标准曲线为y=568.3x+501.83，H2O2浓度为11.45 μM，CAT（样本）=11.45×5÷5=11.45 U/mL。

Catalog No.	Product Name
KTB9050	CheKine? Pro 丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（荧光法）
KTB9300	CheKine? Pro 葡萄糖含量检测试剂盒（荧光法）
KTB9041	CheKine? Pro 过氧化氢（H₂O₂）含量检测试剂盒（荧光法）