还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒实验解决方案-亚科因（武汉）生物技术有限公司

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还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒实验解决方案

2025-01-20

中文名称	货号	规格
			CheKine? 还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（微量法）/CheKine? Micro Reduced Glutathione (GSH) Assay Kit		KTB1600	48T/96T

原理

谷胱甘肽是甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的天然三肽。在红细胞中，还原型谷胱甘肽是维持血红蛋白处于还原状态的关键，保护细胞免受氧化损伤。 GSH 是细胞中最重要的抗氧化剂巯基化合物，在细胞抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜转运中起重要作用。还原型与氧化型比值（GSH/GSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标。测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。CheKine? 还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（微量法）提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本，如血清（浆）、动植物组织、血细胞、细胞及细菌中GSH的含量。DTNB与还原型谷胱甘肽反应生成黄色产物。在412 nm处有最大光吸收，与样品中还原型谷胱甘肽的浓度成正比。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测412 nm处的吸光度）

·水浴锅

·96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头

·低温离心机

·去离子水

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Chromogen：即用型；4℃避光保存。

标准品制备：

Diluted Extraction Buffer：Extraction Buffer用去离子水稀释10倍。取200 μL Extraction Buffer 加入1,800 μL去离子水，Diluted Extraction Buffer用于稀释标准品。

10 mg/mL GSH标准品：每管用1 mL去离子水溶解得10 mg/mL GSH标准品，分装后-20℃，避光保存1个月。

标准品制备：使用10 mg/mL GSH标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品：

序号	Standard (μL)	Diluted Extraction Buffer (μL)	Concentration (μg/mL)
Std.1	40 μL of 10 mg/mL GSH	960	400
Std.2	100 μL of Std.1 (400 μg/mL)	100	200
Std.3	100 μL of Std.2 (200 μg/mL)	100	100
Std.4	100 μL of Std.3 (100 μg/mL)	100	50
Std.5	100 μL of Std.4 (50 μg/mL)	100	25
Std.6	100 μL of Std.5 (25 μg/mL)	100	12.5
Std.7	100 μL of Std.6 (12.5 μg/mL)	100	6.25

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4 h之内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。测定过程中样本在冰上放置，以免变性和失活。

1.动物组织：称取0.1 g组织样本，加入1 mL预冷的Extraction Buffer，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

2.植物组织：称取0.1 g植物组织，加入1 mL预冷的Extraction Buffer，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200W，超声3 s，间隔7s，重复30次）。超声后的样本，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

3.血清或血浆：将收集的抗凝血于600 g，4℃离心10 min，30 min内吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的Extraction Buffer，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

4.血细胞：将收集的抗凝血于600 g，4℃离心10 min，弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗3次（用PBS重悬血细胞，600 g，4℃离心10 min），加入等体积Extraction Buffer，混匀后4℃放置10 min，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

5.细胞或细菌：收集2×106个细胞（菌），首先用冷PBS清洗细胞（菌）2次（用PBS重悬，600 g，4℃离心10 min），加入3倍细胞（菌）沉淀体积的Extraction Buffer重悬，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200W，超声3 s，间隔7s，重复30次），8,000 g，4℃离心10 min，取上清液做进一步分析。

注意：该试剂盒提取的样本也适用于氧化型谷胱甘肽（KTB1610）的检测。因Extraction Buffer中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取相同样本，把Extraction Buffer换成去离子水提取制备。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长至412 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2.在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：

试剂	空白孔（μL）	标准孔（μL）	测定孔（μL）
Sample	0	0	20
去离子水	20	0	0
Std.	0	20	0
Assay Buffer	140	140	140
Chromogen	40	40	40

充分混匀，室温避光孵育2 min，记录412 nm处吸光度值A空、A标、A测。所有孔测定的吸光度A值减去空白孔的吸光度A空，即ΔA标=A标-A空，ΔA测=A测-A空。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA测高于400 μg/mL标准品的ΔA标，将样本用去离子水进一步稀释，乘以最终的稀释倍数，如果ΔA测低于0.01，可增加样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准品浓度为y轴，ΔA_标为x轴，绘制标准曲线。将ΔA_测代入方程得到y值（μg/mL），还原型谷胱甘肽含量 (μg/mL)=y。

2. 含量计算

(1) 按样本质量计算

GSH含量(μg/g 质量)=y×V_样÷(V_样÷V_提取×W)×n=y÷W×n

(2) 按蛋白浓度计算

GSH含量(μg/mg prot)=y×V_样÷(V_样×Cpr)×n=y÷Cpr×n

(3) 按细菌或细胞数量计算

GSH含量(nmol/10⁴)=y÷(数量÷V_提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n

(4) 按液体体积计算

GSH含量(nmol/mL)=y×2×n

W：样本质量，g；V_样：加入样本的体积，2 μL；V_提取：加入Extraction Buffer体积，1 mL；n：样本的稀释倍数；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500万个；2：提取液体时稀释一倍。

结果展示

典型标准曲线：

Figure 1. 96孔板分析的GSH标准曲线。数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

相关产品

Catalog No.	Product Name
KTB1610	CheKine?氧化型谷胱甘肽（GSSG）检测试剂盒（微量法）
KTB1620	CheKine?谷胱甘肽还原酶（GR）检测试剂盒（微量法）
KTB1630	CheKine?谷胱甘肽S-转移酶（GST）检测试剂盒（微量法）
KTB1640	CheKine?谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒（微量法）

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